互动科普

历史上致死率最高的流感病毒又复活了，在1918年（缺损）曾造成数千人死亡。重现这种病毒，让科学家得以研究它高致死率的原因，并追查其根源。

1918年9月7日，第一次世界大战正打得不可开交，美国波士顿市郊的一所陆军训练中心里，有位士兵因发高烧而住院。医生最初诊断为脑膜炎，但第二天改变了想法，因为又有十几人以类似的呼吸道症状住院。16日又出现36例新发病例。令人难以置信的是，到9月23日，这所有4.5万名士兵的军营，共出现了12604个病例报告。在爆发截止时，军营中三分之一的人被这个严重的疾病击倒，其中将近800人死亡。患这种病死亡的士兵通常皮肤泛青，死前因为窒息而痛苦挣扎。许多人在症状出现不足48小时即死亡，尸体解剖发现他们的肺中充满了液体或血液。

由于这些症状的组合并不常见，也不符合任何已知的疾病，所以当时杰出的病理学家William Henry Welch推测：“这一定是某种新的传染病或瘟疫。”然而这种疾病既不是瘟疫，甚至也不新奇，它只是流行性感冒（简称流感）而已。即便如此，这株毒性特强、传染甚烈的流感病毒于1918-1919年席卷全球，据信造成了4000万人死亡。

现代历史上这场死人最多的流感爆发，来得快去得也快；一般人相信，其致病的罪魁祸首也已随时间而消逝。当年没有人将病原体的标本保存下来，以供后人研究，所以直到1930年代，科学家才确认流感是由病毒引起的。不过，多亏美国军队医学博物馆过人的先见之明，加上一位名叫Johan Hultin的病理学家的坚持，以及分析过去的组织样品的基因技术取得进展，我们得以重新取得1918年流感病毒的片断，并能研究其特性。现在，那场可怕的天灾已经过去80多年，从当时少数罹难者身上保留下来的组织中，我们对于这种致命病毒株的性质，以及流感病毒的一般作用方式等基本问题，都能有所回答。

因为流感病毒一直在持续进化，新的毒株还在不断威胁人类，因此，上述这些努力并不仅仅是对历史的好奇。自1918年以来，还发生过两次人类流感病毒的大流行，分别在1957年和1968年。此外，通常只感染动物的流感株，也不时让人类发病，如最近在亚洲爆发的禽流感。我们研究1918年的流感病毒，有两个主要目标，一是要找出导致1918年流感如此致命的原因，以便研发治疗与防治的方法；二是确定这种流行病毒的起源，以更好地定位未来流行株的可能来源。

在许多方面，1918年的流感和它之前及之后的流感很相似。只要有新的流感病毒株出现，带有大多数人的免疫系统从未遇到过的新特性，就可能爆发大规模的流行。不过，1918年的大流行也存在一些特点，长期以来一直是未解之谜。

例如这次大流行的范围之广和引发的病情之严重，是极其少见的。它横扫欧洲和北美，远至阿拉斯加的荒野到太平洋上最偏僻的岛屿，最后全球有三分之一的人被感染。此外，这次流感也特别厉害，死亡率高达2.5~5%，是一般流感致死率的50倍。

到了1918年秋季，欧洲人都称这种病为“西班牙流感”，可能是因为中立的西班牙在战时对各交战国所爆发的流感没有采取新闻封锁，于是这一称呼便深入人心。虽说最早的一波流行，或称春季流感，看来是1918年3月发生在美国的军营及其周边。至于第二波，也就是主要的一波全球大流行，则发生在9~11月。

当年抗生素尚未问世，多数死于流感的人是因为受到肺炎球菌的机会感染而丧生，这些人的抵抗力因为感染流感而减弱。但是有一批流感患者死于更严重的病毒性肺炎，那是由流感病毒本身引起的。患者在出现症状后几天就死亡，其肺部不是严重出血，就是充满液体。死亡率最高的是15~35岁的青壮年。令人惊奇的是，1918~1919年，死于流感而造成年平均死亡率增高的人当中，65岁以下的占了99%以上。

试图弄明白1918年流行病的病因及其特殊性质的工作，在疾病刚结束就开始了，但过了将近80年，罪魁祸首仍未现身。1951年，美国爱荷华大学的科学家，包括一位刚从瑞典来的研究生Johan Hultin，在遥远的阿拉斯加Seward半岛开始寻找1918年的病毒[参见55页框文]。在1918年11月，流感在5天之内席卷了一个现在称为Brevig教区的因纽特人小渔村，造成了72人死亡，占成人人口的85%。死者的尸体一直埋藏在永冻层中，1951年的远征队希望能找到留存在死者肺部的病毒。遗憾的是，所有试图从这些样品中培养活流感病毒的尝试都失败了。

1995年，我们团队开始从不同的来源着手，试图找出1918年的病毒；我们用的是美国三军病理学院（AFIP）的尸体解剖样品。多年来，我们已开发出专门的技术，从受损或腐败的组织中提取脆弱的病毒遗传物质，用于诊断。例如1994年，我们用新技术帮助一名AFIP的海洋哺乳动物病理学家去了解大量海豚相继死亡的原因。此前的鉴定指出，海豚是因所谓红潮而死的。尽管得到的海豚组织已严重腐烂，我们还是从中提取了足够的RNA片断，确定了与引起犬瘟热的病毒相似的新病毒，证实它是海豚致死的真正原因。很快我们开始考虑，能否利用我们研究所的资源，来解决一些古老的医学谜团。

AFIP的前身是1862年建立的美国陆军医学博物馆。随着医学病理专业的进步，AFIP也跟着成长，目前该馆已经收藏有300万件样品。当我们发现其中有1918年流感罹难者的尸检样品时，就决定追查这个引起大流行的病毒。我们最初研究了1918年秋季这波死亡潮中受害者的78件组织样品，这些样品主要来自那些快速死亡而有严重肺部损害特征的病人。因为流感病毒通常在感染之后数天就会从肺部清除，因此，在发病早期死亡的病人的肺组织中，有更大的机会去发现残余病毒。

那个时代的标准做法，是将尸检样品先以福尔马林保存，然后以石蜡包埋；所以要想从这些有80个年头的“固定”组织中掏出含有微小病毒的遗传片断来，可得把我们开发的技术发挥到极致。经过一整年一无所获的痛苦折磨之后，1996年我们终于从一名1918年9月死于流感的美国南卡罗莱纳州的士兵的肺部第一次发现了流感阳性样品，并确定了这样样品的5个流感基因小片断的核苷酸序列。

但为了能确定这些序列的确属于致命的1918年病毒，我们继续寻找更多的阳性病例，并在1997年发现了另一个。这名士兵也死于1918年9月，地点是纽约州的厄普顿军营。有了第二个样品，我们可以确认已有的基因序列，我们担心，这些从尸检获得的微量组织可能使我们永远不能得到一个完整的病毒序列。

这个问题在1997年得到了解决。当时已73岁的退休病理学家Johan Hultin读到我们的初步结果，他提出要重返Brevig教区，再度尝试将埋藏在永冻层的1918年流感受难者尸体挖掘出来。征得Brevig教区的村名委员会的许可，在头一次尝试挖掘46年之后，他获得了4名流感罹难者的冰冻肺部检体。从其中一位年龄不详的妇女身上取出的检体，我们发现了关键性的流感RNA，因此得以定出1918年病毒的完整基因组排序。

最近我们研究组与英国的同行合作，也检测了伦敦皇家医院1918年流感受害者的尸检组织样品。我们已能够从这些病例中分析流感病毒基因，并发现它们与北美的样品非常相似，证实了是同一种病毒在世界范围内的快速传播。但关于1918年病毒株的致命性和起源，这些序列能告诉我们什么呢？回答这些问题需要一点关于流感病毒是如何发挥作用和对不同宿主导致疾病的背景知识。

流感的“变脸”

在过去100年中，导致流行病的三个新的流感株中的每一个都属于流感病毒A型（流感主要有三种形式，分别命名为A，B，C）。B和C只感染人类并从未引起流行。另一方面，已经发现A型流感病毒可以感染很多种动物，包括家禽、猪、马、人以及其他哺乳动物。水鸟类（例如鸭子）是所有已知A型流感亚型的天然“庇护所”，就是说病毒感染了鸟类的内脏却不引起症状。但是这些野生禽类株可随时间突变或是和其他的流感株交换遗传物质，可以在哺乳动物和家禽中产生新病毒。

流感A型病毒的生命周期和基因组结构，使得它可以轻易地进化和交换基因。病毒的遗传物质包括被嵌有蛋白质的脂质膜包围的8个独立的RNA片断。为了复制，病毒结合到活细胞并进入，在这里它霸占了细胞体系，使其制造新的病毒蛋白质和其余的病毒RNA拷贝。然后这些片断组装成新的病毒并脱离宿主细胞，继续感染其他细胞。没有校正机制去保证RNA拷贝的准确性，所以常见到导致新突变的错误。而且如果两种不同的流感病毒感染同一细胞，它们的RNA片断能够在那里自由地组合，产生包含有两个原始病毒基因组结合的后代病毒。这种病毒基因的“再聚合”（reassortment）是产生多种新株的重要机制。

A型流感病毒也可以根据其表面的两种信号蛋白来进行分类。一种是血细胞凝集素（HA），至少有15种已知的突变体（或亚型）。另一种是神经氨酸酶（NA），有9种亚型。暴露于这些蛋白质将导致宿主产生相应的抗体，因而1918年株是第一个被命名的，H1N1是根据流行病幸存者血液中发现的抗体而确定。的确，直到1957年之前，都是较小毒性的H1N1的后代为流感的主要流形株。而1968年以来，导致该年流行的H3N2亚型开始占统治地位。

一个给定的流感病毒A型所表现的HA和NA蛋白质亚型不仅仅是识别者，它们对于病毒的复制是必需的，并且是感染宿主免疫系统（如哺乳动物的呼吸道内皮细胞和鸟类的肠道内皮细胞）的主要靶标。NA蛋白质能够使新的病毒拷贝离开宿主细胞，这样它们就可以继续感染其他细胞。

宿主在最初暴露于HA亚型后，所产生的抗体就阻断了以后的受体结合，因此对此阻止相同株的再感染非常有效。然而对人类来说，还是有HA亚型的流感病毒周期性地出现，而这些病毒大多可能是通过感染野生鸟类的广泛流感病毒的再聚合而产生的。通常源于禽类宿主的流感HA和人类呼吸道大量的细胞表面受体结合疏松，所以禽类病毒HA的结合力在病毒能够复制和在人体有效地传播前一定进行了某种修正。直到最近，有证据提示可能全部的禽类流感病毒都不能直接感染人类，但在1997年香港有18人感染了禽流感H5N1型病毒，其中6人死亡。

2003年和2004年在亚洲的家禽中甚至爆发了更大规模的H5N1型的致病形式，在越南和泰国感染此病毒者有30余人死亡。

当流感病毒感染宿主时，它的毒性是由一组综合因素决定的，包括病毒如何轻易地进入不同的组织，它如何快速地复制和宿主对入侵者免疫反应的强烈性。因此，弄清楚到底是什么导致1918年流行性的流感株具有如此传染性和毒性，我们可能会发现是什么使得流感株成为一个或多或少的威胁。

流感的“杀手真容”

凭借1918年流感病毒的RNA，我们用病毒自身的基因作为配方来制造它的组成构件。本质上，这是杀手病毒自身片断的再生成。我们希望从中首先进行检测的是血凝素蛋白，以找出特点，来解释1918株的特殊毒性。

我们可以看到，例如1918年HA结合到宿主细胞的部分与全部禽流感的HA几乎完全相同。在1918年的两个分离株中，这种受体结合位点和鸟类的形式只有一个氨基酸不同。而在另外三个分离株，也发现了一个氨基酸的改变。这些看起来微小的变异可能表示允许一个禽类HA结合到哺乳动物类受体所需的最小变化。

然而，尽管得到一种新的结合力是允许病毒感染一种新型宿主的重要步骤，它并不能解释为什么1918年株具有如此致命性。我们的目光转向基因序列，寻找直接与毒性有关的特性，包括在其他流感病毒已知的两个变异。一个涉及HA基因:为了在细胞内活跃，HA蛋白质必须由宿主提供的内脏特异性的蛋白切割酶切成两段。某些禽类H5和H7亚型病毒，在切割位点添加了一个或多个碱性氨基酸的基因突变，使得HA被泛醌蛋白酶激活。由这种病毒引起的鸡和其他鸟类的感染，会在多个器官甚至中枢神经系统导致疾病，有非常高的死亡率。这种变异已在最近亚洲流行的H5N1型病毒上被观察到。然而我们并没有在1918年病毒上发现这种情况。

另一种对毒力有明显影响的变异在两种感染鼠类的流感病毒的NA基因上可以看到。而且单个氨基酸发生的突变看起来允许病毒在许多不同的身体组织中复制，这些病毒株对实验鼠是特异性致命的。但我们也没有在1918年病毒上看到NA的这种变异。

因为1918年病毒基因的分析并没有揭示任何可以解释其超强毒性的特性，我们开始和其他几个机构着手重新制造出1918年病毒的一些部分，这样我们就可以观察它们对活体组织的影响。

一种称为基于质粒的逆向遗传学的新技术使得我们可以复制1918年病毒基因，然后再把它们与现存的流感株基因结合，就产生了一个杂交病毒。这样的话，我们就可以用一个鼠类的流感株，使其和1918年流感基因进行不同的组合。然后，用这种工程病毒感染活体动物或人体组织的培养，我们能够看到这种流行株的组成成分是否可能是其致病性的关键。

例如，1918年病毒对上下呼吸道组织产生快速和剧烈的损伤，提示它可以大量复制和在细胞之间快速传播。已知NSI病毒蛋白可以阻止1型干扰素（IFN）——细胞对病毒感染发动免疫反应的一种“早期警告”系统——的产生。当我们在人肺细胞的一个组织培养中检测重组病毒时，我们发现含有1918NSI基因的病毒对于阻断宿主的1型IFN系统确实非常有效。

到目前为止，我们已经生产出包含一个或五个1918年基因的重组流感病毒。有趣的是，我们发现凡是含有1918年HA和NA基因的重组病毒都对鼠类致命，导致与某些流行性死亡病例中相似的严重肺部损伤。当我们分析这些肺部组织时，我们发现基因活化的信号参与了相类似的免疫反应。但我们也发现比通常更高的基因激活除与免疫系统的“攻击战士”T细胞和巨噬细胞有关，还与组织损伤、氧化损伤、凋亡或细胞自杀有关的基因相关。

最近，美国麦迪逊威斯康星大学的Yoshihiro Kawaoka报告了应用1918年流感基因在鼠上进行的类似实验，得到了相似的结果。但当他分别检验HA和NA基因，他发现仅有1918 HA产生了强烈的免疫反应。这提示尽管原因现在还不清楚，却可能是1918株的毒性起关键作用的蛋白质。

这些正在进行的实验提供了一个窥探过去的窗口，来帮助科学家弄清1918年流行病与众不同的特性。类似地，这些技术将用于研究目前的H5N1型禽流感株，它们发生何种变化可能会使这种极具致命性的病毒在人群中具有传染性。一个同样紧迫的问题是，这种具有相当毒性的流感株是从哪里来的，所以我们项目组分析了1918年病毒的基因，以寻找它可能的来源。

分析流感病毒之间关系的最好方法是系统发生学，利用病毒基因序列和关于基因多久会发生典型的变异的只是来构筑假定的系谱图。因为一个流感病毒的基因组包括8个独立的RNA片断，重新聚合时可互不依赖地移动，这些进化研究应在每个基因片断上分别进行。

我们已经完成了1918年病毒的8个RNA片断当中5个的分析，到目前为止所做的1918年流感基因与众多的人、猪和禽流感病毒的比较，发现1918年病毒特性总是与人及猪家族的相似，而不同于禽流感病毒组。然而1918年病毒基因确有一些禽类病毒的特征，所以有可能病毒最初是位于1918年以前某些时间的某个禽类基因库中。但很明显到1918年，该病毒已获得作为人类流行性病毒对哺乳动物的足够适应性。问题是，源头到底在哪里呢？

当我们分析1918年血凝素基因时，发现与1957年H2和1968年H3亚型相比，这个序列与禽流感序列有更多的差异。因此，我们断言，或者1918年HA基因在某种中间宿主身上停留了一段时间，在那里它积累了许多来自原始禽类序列的变化，或者基因可能直接来自某个禽类病毒，但可能是一个与已知禽类H1序列显著不同的禽类病毒。

为了研究自从1918年流行病后80多年里，禽类H1基因可能发生哪些变化，我们与美国史密森学会自然历史博物馆和俄亥俄州立大学的科学家合作。在研究了从那个年代保留下来的许多鸟类样本后，我们的项目组从1917年获取并保存在酒精中的一只黑雁（史密森学会的鸟类馆藏品）上分离到禽流感H1亚型流感株。后来证实，1917年禽流感H1序列与现代禽类北美H1株关系密切，提示禽类H1序列在过去80年几乎没有发生变化。其余野生鸟类H1株的广泛排序可能还会确定一种与1918年HA更相似的株，但也可能没有禽类H1会和1918年株相似，因为实际上，HA并不是直接源于一个鸟类株。

这样的话，一定是有某个中间宿主。猪有很大的可能性，因为已知它们对人和禽流感病毒都易感。确实，在1918年，人和猪同时爆发了流感，但我们相信传播方向很大可能是从人到猪。1918年以来，有许多人类A型流感病毒株感染猪的例子，但从人身上分离出猪流感株只有零星的例子。不过，为了探讨1918年HA可能首先是一种禽类形式，逐渐适应哺乳动物宿主（例如猪），我们考虑了当前关于禽类病毒如何在猪身上进化的例子——过去25年，在欧洲出现了一种禽流感H1N1系。我们发现，即使在猪身上进化了20年，H1N1也没有导致1918年流行株的禽类序列发生多大的量变。


把这种类型的分析应用于其他4种1918年病毒基因，我们得出了相同的结论：引起1918年流行病的病毒很可能是从典型的野生水鸟流感基因库进化了一定时间并得以分离的禽类株，其中之一就像SARS冠状病毒，来源于一种还未知的动物宿主，却在人群间流行。

未来的研究


我们对1918年病毒的5个RNA片断的分析给其起源问题带来了希望，并强烈提示这一流行性病毒是后来人和猪H1N1系的共同祖先。到目前为止，病毒基因的分析并没有对1918年病毒株的特殊毒性提供明确的线索。但含有1918年基因的工程病毒的实验显示，某种1918年病毒蛋白可以促进病毒的快速复制和引起极具破坏性的宿主免疫反应。

未来的工作中，我们希望可以把1918年流行病毒株放在紧挨着它的前后流感病毒中来研究。流行病毒的直接前驱者（最初或春季的病毒株），缺乏秋季病毒株的特殊毒性，并看起来不那么容易传播。目前我们正在从春季病毒株的罹难者身上找寻流感样品的RNA，以确认春秋病毒株的基因差异，这有可能帮助解释为什么秋季更严重。同样地，找寻1918年以前的人流感RNA样品，将证实1918年病毒的哪个基因片断对人来说是全新的。在1918年流行病中青年人不同寻常的死亡率，可能解释病毒是否和对老年人有免疫力的早期循环株有共性。而找寻1920年及其后的H1N1样品，将帮助我们理解1918年病毒随后进化到减毒形式。

我们必须记住流行性感冒株起源的机制并没有被全部理解。因为1957年和1968年流行株有类似禽类的HA蛋白，看起来很有可能它们起源于禽类和人病毒株的直接重组。然而这些再聚合事件的真实环境还从未确定，所以没有人知道新株需要经过多长时间的发育才能成为人类的流行病。

1918年流感株更令人困惑的是，它的基因序列，无论与已知的禽类株的直接重组或者是适应于猪的禽类株都不一致。如果1918年病毒被证实通过不同的机制而不是通过随后的流行株获得了新的基因，这里面可能存在重要的公共卫生问题。1918年株的特殊毒性可能还有另一起源。许多别的禽流感病毒的排序，以及除了猪之外其余的中间宿主（例如家禽、野鸟或马），可能给1918年流行病的起源提供更多的线索。除非更清楚地了解这些毒株的起源，否则探查和预防措施也许不能阻止下一次流行病爆发。