互动科普

基因疗法的非病毒策略

Philip L. Felgner*

用非病毒系统可以克服病毒的基因传递媒介的许多缺陷。对患者的研究表明，这些系统可以起治疗和疫苗的作用。

    正如Theodore Friedmann在本期“克服基因疗法的障碍”一文提到，许多开发基因疗法的研究采用修饰了的病毒把为可能具有治疗作用的蛋白质编码的基因送入人细胞中。其目的是诱发被病毒侵人的细胞将该基因转移到细胞核中。然后这种细胞应“表达’（即制造）该基因确定的治疗所需的蛋白质。

    病毒可以有效地把基因转移到细胞中，因为它们已演变出了专门的机制，可使它们与特定类型的细胞结合，并把它们的载荷高效地传递入细胞的内部。然而治疗中使用病毒作为基因传递的运载工具（即媒介）还留下了一些问题.某些病毒能够破坏被它们感染的细胞之DNA，具有潜在的有害效果。此外，弱化的病毒在体内有可能发生变化并重新获得它们的致病性作用。另一个严重的局限性是患者可能产生对此微生物的免疫应答。这种免疫应答能迅速地使一种基因疗法成为无效的，因为它们在此治疗基因有机会帮助患者之前就可以破坏病毒本身或可能杀死被感染的细胞。

    由于这些原因，研究人员很早以前就希望在传递治疗基因进入细胞时不使用感染性的媒介。此外，医生们在过去5年左右已终于认识到，对于可能最终被基因疗法治疗的许多疾病来说，或许将需要反复治疗，而不是旨在产生永久性治疗的一次性治疗方法。非病毒法可能特别适合于反复使用，因为它们不会引起可能损伤病毒媒介的免疫应答。

    我已研究过的、现在正在对人体进行试验的一种方法使用由DNA和非致免疫的类脂组成的复合物。近几年来还注意到了下述惊人的发把“裸”DNA注入试验动物和患者体内能够激发起被编码的蛋白质的表达。正如将要看到的那样，这第二种方法具有新疫苗的特殊前景。

电的问题

    科学家们很早以来就对通过选择的途径把外来DNA置入细胞来改变细胞着了迷。加利福尼亚大学圣迭戈分校的John Holland和他的几位同时代的人早在五十年代中期就已证明，细胞能够吸收从病毒中提取到的核酸（RNA或DNA）并把它们表达为蛋白质。这一发现向科学家们提供了一个诱因去改进基因“转染”（把功能性基因传送到细胞中）的效率。

    在六十年代期间，研究人员确定，细胞吸收DNA的主要障碍在于，在水溶液中（例如体内细胞沐浴的环境）, DNA分子具有负电荷。这意味着它往往会被从细胞膜排斥，因为这些细胞膜也带负电荷。因此研究人员开发了能使DNA与那些中和其电荷因此使得它更容易被吸收的化学物质结合的一些方法。其中的一种方法利用叫作二乙氨乙基葡聚糖（DEAE一dextran）的带正电荷的有机聚合物。另一种方法使用无机磷酸钙。

    研究人员通过这些方法已确认人细菌培养物能够接纳基因并永久性地表达它们。一个重要的试验使用从单纯疱疹病毒分离的脑苷激酶的基因。当此基因与磷酸钙复合时，某些细胞能与此基因结合并产生稳定形式的胸昔激酶。

    七十年代末，随着从细胞中获取单个的基因并把它们拼接到质粒—在细胞内自然增殖的DNA的柔性环—中技术的发现，现代生物技术工业就开始了。因此重组DNA技术使研究人员得以生产特定基因的大量拷贝。斯坦福大学的Paul Berg及其同事通过把从细菌中获得的重组质粒传递给培养的哺乳动物细胞而把重组DNA与化学细胞转染技术融合在一起。拼接入这种质粒的基因之表达表明，这些基因已被引入核中，因为基因一般不能被表达，除非它们被核蛋白所作用。这些非病毒转染法此后被用来生产许多哺乳动物细胞株系，现在工业上利用这些株系生产医用重组蛋白，如用于血友病患者以改正潜在的威胁生命的血液凝固问题的V III因子。

现有的类脂

    尽管化学技术具有商业价值，但大多数研究人员认为，对于基因疗法来说它们的效率太低。然而Berg和加利福尼亚大学旧金山分校的Demetrios  Papahadjopoulgs通过把细胞暴露于含基因的脂质体一一由外部的类脂（脂肪）膜和内部的水溶液组成的微小空心球一一也成功地用基因转染细胞。哈佛大学医学院的Claude Nicoloau获得了同样的结果。这项研究还表明，质粒的基因进入了细胞核、在核内细胞机器对引人的基因起作用，而且使得它们表达为蛋白质。

    六十年代英国剑桥巴布雷厄姆研究所的Alec D.Bangham首次描述了当某些种类的类脂被悬浮于一种水溶液中时脂质体能自发形成。脂质体类似于动物细胞，其中外膜由两层类脂分子组成。因为所使用的类脂分子有一个嗜水末端和一个憎水末端，所以具有这种特性。在水溶液中，它们形成双层的膜，其中嗜水的顶端对外朝向含水的外部环境，还对内朝向脂质体的充满水的中心。这种象细胞一样的情况很久以来就向研究人员表明，“负载着”某些药物的脂质体能够与细胞融合并把脂质体的内容物传递到细胞内部。

    用脂质体的结果是令人鼓舞的，然而一个技术上的问题使它们被实际用来把质粒传递到细胞中的进展放慢。脂质休的内直径—约0.025至0.1微米—一般比DNA质粒最长的尺度小得多，后者可能长达2微米。这种不适当的匹配意味着，当在质粒存在下合成脂质体时，只有很少紧紧缠绕的质粒被封闭。

    尽管如此，乐观的科学家们还是相信，可以找到改善这种封闭率的方法。我和我的同事在加利福尼亚州帕洛阿尔托市的Syntex研究听进行的研究作出了如下的推理:我们或许能够修饰脂质体使其更有效地俘获质粒并更容易地把它们的内容物传送给细胞。

    我们的想法是制造这样的脂质体，其中一些标准的类脂被在嗜水末端带正电荷的类脂所置换。我们认为，这应该使得脂质休更容易与DNA和RNA以及与细胞表面接触。然而在那时（1983年）只有极少具有构成脂质体的正常形态的带正电荷（阳离子）类脂的例子。

    因此我们合成了预计会有正确特性的不同阳离子类脂。这种分子的行为正如所料，而且所得的阳离子脂质体与组织培养物中细胞的表面牢牢地结合在一起。此外，直接把质粒与约8倍于它们质量的阳离子类脂混合，我们能有效地俘获所有DNA。我满意地发现，我能很容易地创造生产物理上稳定复合物的条件。

利用发现

    由质粒与阳离子类脂的混合物生成的结构比简单的脂质体更为多变和更为复杂。例如我们常常发现封入管子状类脂结构的质粒。此外在正确的条件下，含有质粒的类脂管能折袅形成有类脂壁的致密颗粒。这种结构有点象某些病毒的结构。因为由阳离子类脂形成的结构与简单的脂质体是如此之不同，所以研究人员近来已一致同意给它们取了一个新的名称：lipoplex。

    我曾以为在lipoplex能把它们的有效负载传递到细胞中之前必须进一步修饰它们。然而值得注意的是，在我的实验室里一名实习的大学生证明，这些基本的结构以显著的速度转染细胞。自那以后混合阳离子类脂与DNA己变为把基因插入培养细胞中的标准方法，而且现在为此目的的许多阳离子类脂制备物可作为商品买到。

    近来研究人员己开始研究人体中的lipoplex。第一个候选治疗药物由含有称作HLA一B7（一种所谓的主要组织相容性抗原）的免疫系统蛋白质之基因的lipoplex组成。当癌细胞表达HLA一B7时，它们刺激患者的免疫系统以把它们识别为外来物并选择性地破坏它们。在Vical公司资助的临y治疗计划中，90多位对标准癌治行法无反应的患者肿瘤中注入了含编码HLA-B7的DNA的lipoplex。

    在大多数病例中，研究人员能够证明这种治疗方法刺激了HLA-B 7蛋白质的产生。60位患者患恶性黑素瘤。在这些病例中约二分之一中，注射了lipoplex的肿瘤缩小或消失。晚期的黑素瘤往往在全牙都广泛扩散，因此把药物注入可见的肿瘤中不可能治疗大多数病例。然而我们的鼓舞人心的初步研究结果表明，lipoplex能够帮助治粉黑素瘤。有时用lipoplex进行治疗甚至使得未注射药物的肿瘤也收编。用含HLA一B7的基因lipoplex所作的其它研究旨在确定类似治疗对不宜手术的结肠癌、肾愿和乳腺癌的安全性和有效性。

    Vical公司还正在资助含免疫系统蛋白质白细胞介素-2（IL-2）的基因之lipoplex配方的临床试验。IL一2被注入患者以治疗肾癌，但是它有严重的毒性副作用。lipoplex注入肿瘤后，通过局部产生高浓度的IL一2而刺激免疫系统，同时避免了大多数有毒副作用。

    此外，Genzyme General Division公司在囊性纤维变性患者中进lipoplex研究。为了治疗这种疾病，lipoplex带有该疾病所缺乏蛋白质—囊性纤维变性横跨膜传导凋节剂—的基因。用气溶胶喷雾法将lipoplex传递到患者肺中，这种蛋白质在肺中的表达应能缓和某些最严垂的症状。

用lipoplex配方在动物中可获得的鳌因表达水平在某些例子，可与病毒基因传递系统所获得的水平相匹敌。然而这两个系统的效率有很大的差异。有些病毒在把它们的基因组传递给细胞方面几乎100%的有效，以致1000个病毒能够感染几乎1000个正确类型的细胞。而为lipoplex转染1000个细胞，约1千万个该基因的拷贝装在类似数量的lipoplex中，使这种方法的效率约低1万倍。

 我们和其他人正在追求的改进lipoplex效率的一种方法是，把一些专化性蛋白质或蛋白质断片—它们相似丁引导病毒瞄准特定细胞类型的蛋白质或其断片掺入到lipoplex的外表面中。我们也能在转染的细胞中加入其它分子以促进基因的生存和功能发挥。例如一般帮助病毒从细胞内部的废物处理系统逃出的所谓病毒膜融台蛋白质能够被掺入。此外，研究人员正在对把称作核瞄准信号的呆些病毒蛋白质（有助于指引病毒基因到达细胞核）附着到基因上的方法进行试验。

 同时我们和其他人还在迫求应用裸DNA。八十年代末，在lipo-Alex进入临床试验很早以前，我和我的同事、威斯康星大学的Jon  A.Wolff 和Robert W.Malone以及其他一些研究人员作出了一项惊人的发现。由于希望确定哪一种类脂配方能最有效地把基因传递到细胞中去，我们曾决定在我们把带有一种特殊的容易监测的基因的lipoplex注入不同的小鼠组织后测量那种基因的表达。

那是一个值得纪念的日子，那天我们分析了来自我们的首次试验的数据，并看到我们在骨骼肌中所获的基因表达水平。可与我们曾在培养物中以转染细胞所获得的最好结果相比。然而下一次观测是史无前例的。我们发现，在某些测试中我们曾用作一个对照试验的DNA本身所得的表达水平相似于或大于类脂配方的水平。

裸DNA

 在我们的不同实验室中我们几次重复这些试验，然而结果总是以相同的方式出现，注入动物肌肉中的裸DNA被友达为蛋白质。此外，我们能够达到相当高的局部蛋白质浓度，即每克肌肉组织高达100纳克的基因户物。

    尽管细胞表面和DNA之间会产生电斥力，但似乎有少数细胞仍然能够同化这种分子。直到今天仍然不清楚它们是怎样同化的，也许在注射位置少量的组织报伤或增大的压力在起作用。

原则上，似乎可能用裸DNA注入患者的肌肉中，然后它将产生其数量治疗作用的选择性蛋白质。例如，很需要以更好的方式把胰岛素传递给患者以治疗糖尿病或传递凝血蛋白质因子中以治疗血友病。然而在这些早期的研究中，当蛋白质在血流中被稀释到3升血浆中时，在肌肉产生的局部高浓度蛋白质对这些疾病并非是足够有效的。

    由于质粒设计的改进，我和我的同事近来已取得了进展。我们发现，用编码促红细胞生成素的裸质粒注入小鼠中，我们能刺激小鼠红血球的产生。在化疗和放疗之后用这种激素来帮助患者长出新的红血球。将来或许用相似的重组质粒注入肌肉中将是传递促红细胞生成素本身的一种比较廉价的代替法。

    在近期，裸DNA可望用作疫苗，因为更加少量的蛋白质能够制激保护性的免疫应答。免疫学研究已表明，蛋白质能诱发两种不同的免疫。第一种为体液免疫，是免疫系统破坏了一种病原后形成的。然后受损伤的微生物被把外来蛋白质展示给叫作B淋巴细胞的抗体分泌细胞的特殊细胞所吸收。这种B淋巴细胞通过产生可识别特异外来蛋白质的抗体而产生反应。这些抗体将与无论什么时候再次碰到的原有病原迅速地结合，中和它或用免疫系统的其它成分标记它以便将其破坏。

    第二种响应称作细胞免疫，当侵入的病原定殖在细胞中并迫使它们制造更多的病原时发生。然后病原蛋白质的短片在受感染的细胞表面上显示出来。这种免疫系统通过产生其它淋巴细胞—可识别这些断片的活化T淋巴细胞—而起响应。这些T淋巴细胞不产生抗体而是直接破坏正在显示这些关键断片的细胞。如果此病原再次侵入身体，受感染的细胞显示这些断片并因此而遭破坏。

    我和圣迭戈加利福尼亚大学的Dennis A.Carson推断，因为裸质粒DNA侵入细胞，所以它或许能刺激细胞免疫及体液免疫。由Gary H.Rhodes进行的我们最早的试验证明，把编码人类免疫缺损病毒（HIV）的外壳蛋白的质粒注入小鼠，就刺激了小鼠产生与HIV蛋白质结合的抗体。随后Rhocdes证明，这种质粒也诱发了细胞免疫应答。在实验室试验中，来自这些动物的T淋巴细胞攻击显示HIV蛋白质断片的细胞。

向前看

当来自我的实验室的Suezanne E.Parker证明带有流感病毒的一个基因的质粒能够用来免疫小鼠，并因此保护它们。换句话说免受致命病毒剂星的侵害时，这一登峰造极的成就实现了。在Merck公司的Margaret Liu及她的同事已在动物中证实了这些研究结果，并把它们推广到能产生持续很久的细胞免疫应答和体液免疫应答的各种潜在性DNA疫苗的开发中。Merck公司有一种裸DNA流感候选疫苗正处于人体临床试验阶段中。

    在不太遥远的将来我们就能期望看到抗地疹、疟疾和HIV的DNA疫苗投入临床试验。在史长远的期间内，结核病、乳头状瘤、衣原体病和肝炎也可能会成为DNA疫苗瞄准的目标。这种疫苗不仅能防止感染，还能刺激已发病的人的免疫系统。正在筹划对淋巴瘤（一种白血球癌）的裸DNA治疗法的临床试验。

    lipoplex和裸DNA不是基因治疗的唯一非病毒法。研究人员还在研究与DNA形成复合物的各种非类脂阳离子聚合物。称作PolvAlex的这些结构正在实验室中和在临床试验中显示其希望。

    非病毒基因疗法的一个重要目标将是开发能够被注入血流的传递系统。因此将把它们的DNA序列传递到如肺、肝、脾或骨髓这些适合的组织。能够以药丸的形式被吞下的基因传递系统会使基因疗法更加方便。此外，如果传递系统能够被作成专门以肿瘤细胞为目标，那么它们能以不同方式改进癌症的治疗。最终基因疗法能够被用来改正有遗传病或癌症的人之细胞的突变基因。称作基因靶（gene targeting）的一种技术提供了一种可能的方法，该法采用 lipoplex己成功地被应用于培养细胞中。

    通过lipoplex, polyplex和裸DNA等非病毒方式把基因传递到细胞中现在是一个重要的和不断扩展的医药研究和开发领域。如果保持目前进展的步伐，在未来的几十年里就会看到基于这种技术的许多产品以常规的方法被投与患者以治疗和预防普通疾病。

〔刘义思 译 郭凯声 校）