互动科普

克服基因疗法的障碍

Theodore Friedmann*

    提供必需的基因来治疗疾病的方法仍然是一个令人感兴趣的想法，然而在基因疗法成为现实之前，临床与基础研究人员仍有许多工作要做。

19世纪末，当先驱者建筑大师丹尼尔. H. 伯纳姆在设计一些最早的现代摩天大楼时，他的一些合伙人和朋友都表示怀疑—这耸入云端的建筑物竖得起来吗？据说，伯纳姆警告了这些怀疑者，不要去搞那些“无法激起人们热情”的“登不上大雅之堂的设计方案”。他要他们突破传统建筑体系的桎梏，构思要大胆新奇惊世骇俗，要做出前人不敢想象的壮举—一句话，要敢于革新敢于革命！

    在过去的几个世纪里，医药领域同样发生了革命性的变化。显微技术、麻醉技术、疫苗接种、抗生素和器官移植等新技术的推广采用所带来的新认识、新作法可以为证。目前，医药领域正准备经受又一项划时代的变化—开创一个崭新的时代，让一系列的遗传性疾病和后天性获得性疾病都可以通过常规方法植入健康基因而治愈或减轻。

      是的，医学界正在为一项根本的变革作好准备，而尚未处在这场变革之中。一些过分热忱的研究人员、工业界的代表人物、外行人以及科技传媒的成员过高估计基因疗法，大大低估了基因疗法的不定性，似乎基因疗法已经成熟，可以广泛采用了。然而，事实并不是这么一回事。

    可以论证的是，基因疗法革命作为一种概念确实已经产生。每当发现了一种新的基因，研究人员和非科学家总要马上弄清楚，它是否可用于治疗某种疾病，即使是在可以应用更为传统的方法的情况下。然而，作为一种技术的基因疗法革命—可以治疗疾病的能力—则是另一回事。目前，研究人员已完成了必要的最初步骤—几年来，他们多次证明，可以诱使转基因在人体内起作用。目前，全世界已有2000多名患者作过基因疗法试验，然而迄今为止，还没有一个患者的健康因采用基因疗法而得到确切的改善。

    由于基因疗法目前还缺乏令人信服的治疗效果，使得人们的头脑逐渐冷静下来。但若是因此而怀疑基因疗法将在未来产生强有力的治疗作用，那就错了。人们不应忘记，基因疗法还是一个年轻的领域，在美国，对患者进行基因疗法试验的历史还不到10年。迄今为止，基因疗法在临床上只取得了平庸的效果，对于这一点，更为实际的解释是，说明研究人员对一项艰难而又新颖的技术的探索还只是初始而不完全的，而基因疗法的障碍则比我们当中的许多人预计的更加难以克服。

    正如一项联邦政府委托进行的对基因疗法研究计划的审评报告在1995年指出的那样，一个主要的难题是如何改进向细胞提供治疗基因的方法。导入患者体内的基因时常不能到达足够多的靶细胞，或者出于一些并不总是很清楚的原因，不能发挥正常作用或过了一段时间之后作用就停止了。在上述情况下，本来具有治疗潜力的基因就几乎没有机会去改变疾病的进程。

在本文中，笔者除了概述一些最为紧迫的妨碍成功导入基因的技术障碍，还将概述正在研究之中的对付这些难题的方法。笔者在文中将只涉及改变体细胞——既非精细胞亦非卵细胞的细胞——的基因疗法。到目前为止，针对人类基因疗法的研究均避免采用（或许是以无意识的方式）故意改变接受基因疗法的个体的后代的那些作法。由于最近一只成年绵羊的克隆成功（参见本期Steve Mirsky和John Rennie 所撰“克隆对于基因疗法意味着什么”一文），使得公众在启蒙开导下就病毒媒介基因疗法的利弊展开争论的必要性更为紧迫了。

基因和基因疗法如何起作用

    任何一个想要了解基因扮法障碍的人，都必须先了解一点关于基因的作用以及日前的基因疗法试验是如何进行的知识。人体细胞中的单个的基因是一段DNA。在大多数情况下，它起着生成一种特定的蛋白质的蓝图的作用；基因同时规定若构成该蛋白质的氨基酸的顺序。生物体内的所有细胞都在细胞核的染色体内带有相同的基因。然而比方说，神经细胞的行为模式不同于肝细胞，这是因为不同的细袍所不用即表达的是截然不同的基因的子集，因此所生成的蛋白质集合（细胞的主要功能单位）也是分立的。更确切地说，每个细胞只把所选用的基因复制成个体的信使RNA分子，RNA分子则起着构成蛋白质的模板的作用。

如果一个特定的基因发生了突变，那么其蛋白质产物或者不会产生，或者不能发挥正常作用，甚至肯呢个还具有侵害性。总之，这种缺陷基因会扰乱利用正常的基因产物的细胞和组织的必不可少的功能，因而会引起疾病的症状。

在历史上，医生治疗起因于遗传性基因突变的疾病，但不是采用用改变基因的方法，而是对起因于突变的生物学事件进行干预。例如长期以来，医生对苯丙酮酸尿症的治疗措施都是要患者节制饮食，在患有这种病的情况下，一种基因的缺失导致一种氮基酸—苯丙氨酸—的代谢产物在体内积聚而引起中毒。遗憾的是，非基因疗法对遗传性疾病通常只是部分有效。

    本世纪70年代初期，由于上述事实以及人类时基因功能的日益了解，再加上对许多遗传性疾病后面潜藏的基因的发现，使得人们想到，用攻击遗传的先天根源的方法来治疗这种病或许能够取得更好的效果。现已研究过的遗传性疾病包括囊性纤维变性（此病主要影响肺脏、进行性肌营养不良症、腺苷脱氨酶缺失症（此病严垂损害免疫力），以及家族性高胆固醇血症（此病导致严重的动脉粥样硬化的早期发作）。

    令人惊奇的是，随着时间的推移，有一点变得很清楚，那就是即使是后天性获得性疾病也时常带有一种遗传成分，从理论上讲，这种成分可以作为一种遗传修正疗法的靶标。事实上，十分出人意料的是，目前的所有基因疗法临床试验中。一半以上是针对癌症的，而癌症在大多数情况下并不是通过遗传得来的，而是出生后遗传损害累积带来的结果（参见本期R.Michacl Blaese所撰一治疗癌症的基因疗法”一文〕。此外，还有一些临床试验是针对艾滋病的，而艾滋病则是由人体免疫缺失病毒（HIV）引起的。

    从理论上讲，可以将一种正常的基因导入人体，从而使之在物理作用上取代染色体上的一种有缺陷的基因。实际上，这种把缺失的基因作为靶标并将一种正常的基因插入染色体中的方法至今尚未在人体上获得成功，幸而这种方法工不是非用不可的。大多数基因疗法试验只是将一种有效的基因加入选中的细胞类型，从而补偿一种缺失的或无效的基因，或输入某种全新的功能。许多拟用的尚在研究中的抗瘾基因疗法所采用的都是这最后一种方法—其目的在于诱使癌细胞产生出一种能直接杀灭癌细胞的物质，促使免疫系统对癌细咆进行强有力的攻击，或者是阻断癌肿生长所必需的供血。

    遗传突变会导致生成破坏性的蛋白质，世界上的一些基因疗法研究小组目前正在设计纠正这类突变的方法。在一种称为“反义疗法”（antisense therapy）的方法中，短段合成的DNA对突变基因的信使R NA转录下产生作用，以防止这些转录本被转变成异常的蛋白质。类似的一些方法则利用称为ribozymes的小分子来RNA降解由畸变的基因复制成的信使RNA，一种有很大不同的方法为一种称为“胞内抗体”的蛋白质提供一种基因，它能阻断突变的蛋白质本身的活性。一些疗法则依靠设计DNA和RNA的混合物，它们或许能够引一导突变基因的修复。

    目前，为病人提供基因是通过两种基本的方法，在这两种情况下，基因通常都是先被置人转运物即媒介之内，它们能使外来的基因进入细胞之内。在更为常用的方法中，研究人员从患者体内被选中的组织上取下一些细胞，并将它们与实验室条件下（体外法）的基因转移媒介接触，然后再将遗传上已作改变的细胞回输到患者体内。在其它一些时候，研究人员则将基因转移媒介直接导入患者体内（体内法）。一般是导入计划治疗的组织之中。当然我们的最终目标是将基因转移媒介输入血流或其它部位，并使这些媒介象信鸽一样，找到自己的途径而到达所要求的细胞—比方说，难以到达的器官或者隐藏的癌症病灶。尽管到目前为止，还没有一种自动寻的基因导入媒介己作好临床试验的准备，但针对这一目标的研究工作仍在取得迅速的进展。

    在体内，某些基因将有助于疾病的治疗，唯一的条件是，其表达受到严格的控制—换句话说，这些基因必须在适当的时间产生出适当数量的蛋白质。生物学研究人员还需要实现对导入体内的外来基因的这种精确控制，然而对于许多基因疗法的应用实例来说，这种精确的控制将不会是必不可少的。将基因导入需要修正的细胞中也不会总是必要的。有时候，更容易进入的细胞类型（比方说，肌肉细胞或皮肤细胞）或许能被转变成蛋白质制造厂，它们将释放出邻近的细胞所需要的蛋白质，或者是将蛋白质分泌到血流中以转移到遥远的部位。

反转录病毒媒介—缺陷与修复

    任何一种基因疗法要想获得成功，关键是要让一种媒介能够用作安全而有效的基因导入手段。从一开始，病毒（与自复制的包裹在蛋白质外膜中的基因几乎没有差别）作为潜在的媒介，就引起了最大注意。病毒之所以引起了重视，是因为进化已将它们特别设计成能进入细胞并在其内表达其基因的形式。此外，研究人员能够用一个或更多的有潜在疗效的基因来取代与病毒的复制和毒性有关的基因。从理论上讲，这种遗传物质已变换，已去除毒性的病毒应能将有治疗作用的基因导入细胞，而不能增殖或引起疾病。

    到目前为止，受到最为广泛的研究的病毒是反转录病毒，这种病毒能将其基因的拷贝永久地拼接入受其侵染的细胞的染色体中。如此结合而成的基因会被复制和传递给受侵染的细胞的未来所有各代细胞。相反其它许多种病毒则不会将其遗传物质结合进寄主的染色体中。这类病毒的基因通常只是较为短暂地在寄主体内起作用，部分原因在于受体细胞分裂时，这类基因并不进行复制。

    反转录病毒媒介的一组理想的靶细胞包括所谓的干细胞，这种细胞不仅会长时期地持续存，同时也会产生较为专化的后代细胞。例如造血的干细胞会产生其它各种血细胞（红细胞、免疫系统的白细胞等等），并且会随着需要而再生血液；此外它们还会自我复制。然而，在目前情况下人类的干细胞不仅极其难以鉴别，而且极难以安全而可预测的方式进行修饰。

    反转录病毒初次被用作基因转移媒介是在本世纪80年代初期，然而，尽管这种病毒很有吸引力，但它们同时也带来了一些难题。反转录病毒具有不加区别的特性，能将其基因同各种各样的细胞的染色体结合。由于如此缺乏对寄主的良好专一性，它会妨碍把媒介直接送入体内。若是这种病毒被不是打算用来接受外来基因的细胞吸收了，就会减少基因向靶细胞群的转移，并有可能产生有害的生理学效应。令人遗憾的是，目前研究得最多的反转录病毒未能将治疗基因转移到不会分裂或极少分裂的细胞类型（如成熟的神经细胞和骨骼肌细胞）。目前的反转录病毒媒介只有在寄主细胞核包膜分解了的情况下才能到达染色体，而细胞核包膜分解则只有在细胞产生分裂的情况下才会发生。

    反转录病毒随意将其DNA拼接入寄主细胞的染色体内而不是在可以预测的位点，这一点也带来了问题。被插入的基因有可能破坏一种必不可少的基因或改变一些基因而使之有利于癌肿生长，具体结果如何则取决于被插入的基因所到达的是寄主细胞的哪一个位点，癌肿或许只是在很少的情况下才会增生，然而，即使癌肿增生的机会很少，它也必须得到严肃认真的对待。

    最近，在克服反转录病毒作为基因导入媒介的缺陷的过程中，研究人员己取得充分的进展。例如，为了增强反转录病毒的专一性从而使得反转录病毒媒介能够把自身导入人体内的特定细胞研究人员正在改变病毒的被膜（病毒的最外层）。和其它病毒一样，反转录病毒也能使其遗传物质进人细胞内，唯一的条件是从其表层抛出的蛋白质要能在细胞上找到特定的受体。病毒蛋白质同细胞上受体的结合能使反转录病毒的被膜同细胞膜融合并将病毒的基因和蛋白质释放到细胞的内部。为了提高反转录病毒对其侵染的细胞的选择性，研究人员正设法弄清如何取代或修饰天然的被膜蛋白质，或将新的蛋白质或蛋白质的部分加入到现有被膜之中。

    在一项证明取代法可行的实验中，加利福尼亚大学（圣迭戈）的伊金宽（Jung一Kuan Yee）同笔者在该校的实验室一起，用人类疱疹性口炎病毒的被膜蛋白质取代了小鼠白血病病毒的被膜蛋白质。（这种小鼠病毒在人类中未引起任何已知的疾病、是作为基因疗法媒介的反转录病毒中被测定得最为广泛而彻底的。）这种遗传物质已变换的小鼠反转录病毒随后侵染了带有人类疱疹性口炎病毒受体的细胞，而不是带有小鼠白血病病毒受体的细胞。

    关于修饰现有被膜蛋白质的研究工作也取得了可观的进展，阚月（Yuet Wai Kan）及其在加利福尼亚大学（旧金山）的同事最近将一种蛋白质激素同这种小鼠白血病病毒的被膜蛋白质结合起来了。这种激素使得该病毒能够侵染显示出该激素受体的人类细胞。

    研制能将治疗基因导入不会分裂的细胞染色体的反转录病毒媒介的前景也在好转。英德M、弗玛（Inder M,Verma）、迪地尔、特朗纳（Didier Trono）及其在圣迭戈的索尔克生物学研究所的同事已利用一种反转录病毒——人体免疫缺失病毒——的能力，将其基因插入不会分裂的脑细胞核中，而无需等待细胞核包膜在细胞分裂时分解。

    该研究小组从人体免疫缺失病毒中取掉了使之具有繁殖力的基因，并用一种为一种容易跟踪的蛋白质编码的基因取代了它这一媒介随后便将这种可跟踪基因导入不能复制的细胞中，并且无论是在该媒介同培养液中的细胞混在一起的情况下，还是在该媒介被直接注入大鼠脑部的情况下，都做到了这一点。若是失能的媒介会由于某种原因变得具有致病力这一担忧能被消除，那么有朝一日人体免疫缺失病毒本身就有可能证明是一种有用的媒介。另一种方法想必能把某些有用的人体免疫缺失病毒的基因（尤其是那些为能将基因导入细胞核的蛋白质编码的基因）导入不会引起人类疾病的反转录病毒。

最后，研究人员正在作出努力，以确保降低反转录病毒媒介将基因导入人体细胞染色体的随意性。最近，人们知道了基因是如何结合进其它生物体（如酵母菌）的DNA的可预测位点的，从而使在这一艰难的领域苦干的研究人员得到了帮助。

其它病毒媒介的长处和短处

    除了反转录病毒以外，其它病毒作为导入基因的媒介也既有其长处，也有其短处。到目前为止，作为反转录病毒的替代物，最受欢迎的是基于普遍存在的人类腺病毒的媒介。部分原因在于，这类病毒非常安全。一般说来，这类天然产生的病毒除了在健康的人身上引起胸腔伤风（chest colds）外，不会引起任何更为严重的疾病。此外，这类病毒很容易侵染人类细胞，并且往往能产生出高含量的治疗蛋白质，至少在开始时是这样。

    腺病毒媒介能将基因导入细胞核，但显然不能将其插入染色体。这一特点消除了病毒媒介扰乱不可缺少的细胞基因或促进癌肿生成的可能性，然而，对于一些应用来说，令人遗憾的是，育台疗垫因时常只是暂时有效。由于外来DNA最终会在受治疗者体内消失，对慢性病（如囊性纤维变性）的治疗就必须定期重复进行（每隔数月或数年作一次）。然而，在某些情况下，比方说，在只是暂时需要一种蛋白质来引起对癌肿或病原体的免疫反应的情况下，外来基因的短期表达或许更为可取。和反转录病毒一样，腺病毒还有另一种缺陷那就是缺乏对靶细胞的专一性。然而，和反转录病毒的情况一样，研究人员正存迅速设计一些新方法，以使腺病毒媒介专门指向研究人员所选中的组织。

    目前妨碍腺病毒媒介用于患者的更大障碍是人体对腺病毒媒介产生的强烈免疫反应。在最初的一轮治疗中，这类病毒媒介或许能够侵染选中的细胞并产生出大量所要求的蛋自质。然而，寄主细胞的免疫反应很快就形成了，使得遗传物质已变换的细胞被杀灭，新的基因也失活了。此外，一旦这类病毒引起了免疫系统的警觉，这类病毒再一次被注如题内时、就会迅速地被消灭。在患者身上进行的腺病毒些因导入研究中，或许是这类免疫反应促致了些因表达的停止。由于研究人员加深了对腺病毒缺陷的认识，使得新一代腺病毒媒介正在产生，这类媒介应能减轻免疫反应带来的干扰。这些进展之所以能够取得，部分原因在于与引起兔疫反应关系最大的腺病毒基因被去除或突变了。

    目前，研究人员还在探索如何把其它一些病毒用作基因导入媒介，其中包括腺病毒群、痢疹病毒、α病毒（alphaviruses）和痘病毒。到月前为止，上述病毒媒介还没有一种已达到完美的理想水平，但每一种都很可能有其治疗作用。例如腺病毒群之所以有吸引力，是因为它们不会引起任何已知的人类疾病。此外，天然形成的腺病毒群能够将其基因结合到人类细胞的染色体中。腺病毒群很有可能适用于一些目前要依靠反转录病毒的用途，然而，由于其个头较小，腺病毒群或许不能容纳大的基因。相反，疱疹病毒不能将其基因结合进寄主细胞的DNA中。然而，疱疹病毒对神经细胞有吸引力，人受到感染后，有可能终生在一些神经细胞中保留着以大体上无害的状态存在的疱疹病毒。因此，疱疹病毒有充当专治神经病的基因疗法的媒介的潜力[参见木期Dora Y. Ho和Robert M.Sapolsky所撰“用于神经系统的基因疗法”一文〕。

改善非病毒类基因导入系统

    作为一个群体，由病毒产生的媒介继续显示出很大希望，尽管研究人员始终必须努力确保这些病毒不会突变而使之具有致病力。这一问题以及其它一些问题已促使研究人员设计各种导入治疗基因的非病毒方法。和病毒一样，这些合成的媒介通常由同分子结合的DNA构成，这些分子能浓缩上述DNA，将其导入细胞并使之免于在细胞内分解。和病毒媒介一样，几乎可以肯定它们最终将用于治病，然而目前还必须作改进。由非病毒媒介导入的基因已同实验室条件下的受试者的细胞的染色体结合，然而只是在导入体内以后的极少数情况下才做到了这一点。正如笔者已指出的那样，缺乏结合力是长处还是短处，取决于基因疗法的特定目标。

    脂质体为脂肪质小球，其被研究的时间几乎和反转录病毒媒介一样长。这些合成的小球可以设计成能包含一个质粒一种来源于称为噬菌体的细菌病毒的稳定的DNA环，其原始基因己被旨在使之具有治疗作用的基因取代。脂质体（其目前的型式越来越多地被称为“lipolexes”）的基因导入效率比病毒低得多，但脂质体媒介目前已发展得较为成熟，可进入癌症和囊性纤维变性一类疾病的临床试验。与此同时，变换脂质体的化学成分这一举措正在使脂质体基因导入效率较低这一问题得到解决，并正在开始产生模仿病毒的目标命中能力和基因导入能力的媒介〔参见本期 Philip L.Felgner所撰“基因疗法的非病毒方法”一文）

    新型的基因导入媒介是用非脂质外膜来包复DNA。这些外膜包括氨基酸聚合物和其它一些物质，其设计目的在于将治疗基因导入体内的靶细胞，并保护治疗基因使之免遭细胞的酶分解。这些合成物已由维也纳的分子病理学研究所的马克斯·伯恩斯蒂尔（（Birnstiel）和马特·科顿以及亚拉巴马大学（伯明翰）的戴维，T. 柯里尔（（Curiel）进行了深入细致的研究，并在细胞培养实验中表现出了良好的性能。目前，它们正在接受进一步的修饰，并在经受动物研究和临床研究的检验。

    一些研究人员也在探索将所谓的裸DNA（即没有脂质包膜的DNA）注入患者体内的方法。初步的研究结果说明，裸DNA法有着振奋人心的防止传染病乃至某些种类的癌症的免疫潜力。

    目前，对质粒的替代物的研究工作也在进行中。值得注意的是，研究人员在学会构建微型染色体即人造的人类染色体，治疗基因可与这类染色体拼接。这些人造结构将含有最低限度的遗传物质，这是避免在细胞核内被分解和在细胞分裂期间丧失所必需的。此外，这些人造结构还将导入一些要素，这些要素是每当一个细胞分裂时，人造染色体进行精确的且唯一的一次自我复制所必需的，正如通常的染色体所做的那样。

展望未来

    正如目前一样，将来，研究入员将根据治疗的目标，选择某种基因导入法。若是一位患者患有一种遗传缺陷，并且需要在整个一生中持续不断地提供正常的基因产物，那么，一种能将治疗基因导入患者的染色体中并将永远呆在这里的媒介或许是最适合的.然后，可以选择一种反转录病毒或腺病毒群病毒。若是只需要一种基因的短期活性，如激发免疫系统抗击癌细胞或一种传染性病原体的作用，那么，一种非结合性的基因导入工具，如腺病毒媒介、脂质体甚或裸DNA，或许就更为适合。

    然而，几乎可以肯定的是，最终进入普遍的临床应用的媒介，将不会是今日正在试验的原型。此外，由于没有一种方法能适用于所有各种病症，就会有多种选择。未来的理想的基因导入系统将集不同媒介的最佳特点于一体。每一种系统都将按需要修饰的特定组织或细胞类型的要求修正，都将按基因作用的所需持续时间修正，都将按基因产物的所要求的生理效应修正，研究人员还想找到按照人的意愿改变基因表达水平的方法，以及在基因疗法出了差错的情况下停止甚至完全去除导入的基因的方法。

    即使是在这些基因导入媒介达到了完美的水平的时候，它所面临的挑战也不会完结。例如，细胞时常以最终会导致基因停止作用的方式修饰外来的基因。这种活动正在得到有力的对付，但还没有得到解决，此外，在患者的免疫系统遇到了一种看上去是来自一种治疗基因的外来蛋白质的情况下，其免疫系统会作出何种反应我们至今仍然很不了解。要防止不活跃的免疫反应，医生或许必须用扰排斥药物治疗某些患者，或者通过在病人的生命初期（即免疫系统具有充分的能力之前）施行基因疗法，来努力诱发对被编码的蛋白质的免疫耐受性。

    尽管笔者花了不少篇幅来谈论基因疗法的某些技术难题，但笔者还是非常乐观一一基因疗法不久以后将开始证明对某些疾病具有疗效。我们的媒介，在迅速地得到改进，一些正在发展的临床试验显然正处于显示改善症状的真正功力的边缘，即使是在当今的方法尚不完善的情况下，值得一提的是，在今后的几年内，看来很有可能基于基因的免疫疗法将有力地证明对某些恶性肿瘤（如成神经细抱瘤和黑色素瘤）具有减缓病情进一步的发展和迫使现有肿瘤消退的功效，并且将成为对现有疗法钓有益的补充.然而，笔者还必须指出，只有通过坚持严格的科学态度、设计精细的临床研究和如实的成果报道，研究人员才能确保这一令人振奋的新的医学领域及时地、合乎道德地、卓有成效地成熟和繁荣。

    （郑小石 译 巨浪 校〕