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分子生物学研究热带：一种新的基因沉默技术  Gary Stix

在1996年，Worth杂志宣称Isis制药公司有可能成为下一个微软公司，事实证明，这一预言过度夸张了。尽管Isis仍稳坐基因阻断（称为反义）技术的头把交椅，但反义技术治疗癌症和其他疾病的前景一直未见曙光。

在过去的几年中，出现了一种新的基因沉默技术，它可能是一项随时准备替代反义技术去实现人们对后者寄予的厚望的新技术。麻省理工学院McGovern脑科学研究所的主任Philip A. Sharp说“25年来，我一直致力于一项计划：在下一个5年中我要对哺乳动物培养细胞基因失活过程进行各种观察、实验。这些年来我一直在对这些过程进行研究，所有时间都花费在这上面了，但这些过程是如此复杂，以致无法程序化。”

1993年Sharp与人合作获得了的诺贝尔生理和医学奖。他谈到了一系列相关的最新发现——细胞有一种阻断基因表达的机制，称为RNA干涉（RNAi）。RNAi通过阻止基因转录为RNA从而阻止由这些基因编码的蛋白质的产生。例如，当病毒企图侵染一个细胞的蛋白质合成机制以制造病毒的蛋白质时，这一天然的基因沉默机制就开始起作用。

1998年斯坦福大学医学院Andrew Z. Fire和马萨诸塞州州立大学医学院Craig C. Melo的发现是这项研究的里程碑。他们在蠕虫中鉴定出了起开关作用的双链RNA；2001年，洛克菲勒大学的Thomas Tuschl发现一小片段双链RNAi（short interfering RNA，siRNA），它能在哺乳动物的细胞中关闭基因；从1998年到2003年RNAi研究论文的数量由十多篇迅速增加到几百篇。即使这些开创性的发现可能永远无法兑现其治疗学上的某些承诺，但完全有可能获得诺贝尔奖。Sharp评价说“这一发现已触及了我们在生命科学中所研究的从植物到人类的每一事件”（参阅“Censors of the Genome”，Nelson C. Lau和David P. Bartel，科学美国人，2003年第10期）。

令人感兴趣的是作为药物的siRNA与反义治疗究竟有什么不同。乍一看，siRNA和反义药物非常相似。反义药物是通过一个人工合成的含有一个与信使RNA（mRNA）互补的核苷酸链或基因构件，让它们键合到mRNA上从而阻断基因的表达。siRNA同样也是采用使沉默基因的方法，它甚至也是用一个互补RNA链或反义链来做这些。当siRNA进入细胞附着到一个结合蛋白上后——该结合蛋白称为“RNA-诱导沉默复合物（RNA—induced Silencing complex——RISC）”——便被解旋只保留下一条siRNA反义链，携带着siRNA的RISC然后再结合到目标mRNA上将其降解，或者说阻止mRNA编码蛋白质[参阅70页图]。

但是siRNA与几乎已开发了15年之久的反义药物还是有别，最显著的区别在于，它不只是干扰单个mRNA就完了，而像是催化剂，可以重复发挥其效用。最早证明这一技术在动物治疗中潜力的研究者之一、波士顿CRB生物医学研究所资深研究员对其效用的一个说法是：“它们的效力比反义药物高100~1000倍”

目前已有约100家公司参与研究RNAi的工作；近半数公司是作为提供研究所需的化学药品和技术公司而参与的，其他的是一些从事siRNA商业开发的生物技术公司或制药公司。照瑞士Basel市的一家市场调查公司首席执行官KewalK.Jain的说法“所有这些在都发生在过去的两三年之内”。

少数几家公司决定自己生产siRNA药物。随着Tuschl证明哺乳动物细胞中存在siRNA论文的发表，风险投资机构马上活跃起来，马萨诸塞州Alnylam公司的创始人之一、北极星风险投资股份公司（Polaris Venture Partners）合伙人Christoph H. Westphal认为“体外实现siRNA虽还没有得到最后的确认，但赌一把是值得的”。2002年许多早期的RNAi技术发明者，包括麻省理工学院的Tuschl、Sharp和David P. Bartel等，联合起来成立了Alnylam制药公司。后来，生物技术公司巨头——Biogen公司的创始人Sharp又说服了更多业已成立、但对siRNA还缺乏兴趣的公司一起加入到汇聚众多一流人才的Alnylam制药公司。

该公司的Paul R. Schimmel先生，此人为Scripps研究所的分子生物学与化学教授，公司成立前曾组建过几个生物技术公司，他坚决主张公司取名为Alnylam，意为“成串的珍珠”（阿拉伯词语），也是猎户座腰带中间那颗星的名字。Schimmel据理力争，排除其他人的反对，将“Alnylam”读作“al-NIGH-lam”，虽发音困难，但不易忘记，对这种把Alnylam分开成3段的发音方式，在最近的一个投资人会议上，公司的首席营运官Barry Greene玩笑地解释为：“Alnylam开张了（URL was open）”。

公司的创建者组成了一个全明星的科学顾问团队，其中一些人还在校长董事会任职。但公司首任常任首席执行官John M. Maraganore一开始就没有竭力搜索这些重量级人物的博士后研究生来做实际制造siRNA药物的工作人员。Maraganore认为，应该“5个人专注于知识产权，1个人专注于科学理论”。因为随着药物开发和临床实验的开展，专利产业和科学发现具有同等重要的意义，前者将决定公司是蒸蒸日上还是停滞不前。他回忆“我们一直被人盯着，运作的非常艰难，我们意识到，如果我们不抢到第一发明权，其他公司会从我们手中将其夺走。”

组建初期的Alnylam为得到一重要专利的拥有权甚至不惜收购了一家德国公司。由RNAi引起的轰动——被Science杂志评为2002年的“年度大事”——助长了风险资金的介入。迄今为止，吸引来的总资金已达到约8500万美元，这些资金使Alnylam公司足以维持接下来2年的运转，直到第一个通过临床药检安全I期药物的诞生。

RNAi作为一种治疗手段的成败取决于使药物进入目标细胞而不被酶切成碎片。药物必须在细胞中停留足够长的时间完成它的——结合或抑制特殊的信使RNA（mRNA）——功能。药物的给入和稳定性也是一个很大的难题，反义技术在这两方面的优势无疑是对RNAi的一个挑战。

组建初期的Alnylam公司放弃载体药物给入方法的果断作法，可能能够说明这些困难的难度。这种方法一般是使用载体——如用病毒——运送一DNA片断，不仅仅是穿过细胞壁，而是要进入细胞核，由该段DNA（实际上就是基因）对RNAi产生作用从而阻断基因表达。这是一种基因治疗中常用方法，在过去的治疗上已带来一些弊病，如用病毒载体会带来靶的准确度和毒副作用问题，考滤到这些，Maraganore强调“按我的想法，放弃这种给药方式，是因为不想让RNAi治疗带来基因治疗业已存在而又无法解决的问题”。由此而必然地要在实验室中通过核苷酸对串连形成一个含21个核苷酸对的双链分子来siRNA的合成。其他一些公司，如澳大利亚的Benitec公司仍然在继续追寻用RNAi进行基因治疗的技术开发（参阅71页表）。

解决这一难题的核心技术和知识产权的来源有些不可思议。Alnylam公司雇佣了一位从Isis离职经理Muthiah Manoharan任Alnylam药物研发部的副经理。去年夏天Maraganore在致电Isis的董事长Stanly T. Crooke时，向他再一次表示Alnylam希望合作的意愿。几个月后，两个公司之间的达成了一致，Alnylam出资500万美元以获准得到一批Isis公司有关药物给入和使药效稳定的制药工艺专利文件。Maraganore说“这样我们将能借助已开发了10多年的反义药物技术的优势”。反过来，Isis公司为Alnylam公司投资1000万美元，给予Alnylam公司5%的股权、一系列特许权及一旦siRNA产品上市时所需的费用。同时Isis也得到某些siRNA药物的生产权。

siRNA的发展轨迹重现了反义药物的发展历程。迄今为止，唯一得到批准的反义药物是Isis公司生产的Vitravene，该药原是为治疗爱滋病人普遍患有的眼疾而生产的，这种药物直接注射到眼内在其靶部位浓缩，以防止药物在身体其他部位产生副作用。但随着其他一些可预防爱滋病人巨细胞病毒视网膜炎的治疗手段的使用，这种药物失去了市场。

小片段RNA最终可能能够被运送到血液中治疗影响全身的疾病。但回顾siRNA药物的历程，从8月份费城Acuity制药公司递交的第一份临床实验——通过眼部注射药物治疗老年性黄斑退化——申请开始，到其他公司，包括Alnylam跟着开展各自治疗老年性黄斑退化的药物实验，所有这些药物的申请中任何的一个都会与Alnylam及其他同类药物研发者平起平坐，成为有希望在这一初露端倪的市场上成为老大。

科罗拉多州Boulder市的一家名为Sirna Terapeutics的公司，这家公司不像Alnylam，它没有起动阶段，9月初就向FDA提交一份治疗老年性黄斑退化的药物申请，比Alnylam可能早半年或半年多，其发家经历颇为戏剧性。Sirna是由另一个公司——Ribozyme制药公司改头换面而来。该公司10年来一直将其命运押在另一种与RNA有关的药物核酶（ribozyme）上。核酶（ribozyme）是具有酶的催化活性的RNA，理论上它能切断mRNA并阻断一个蛋白质的产生。但和反义药物一样，核酶的这种能力带来了问题：一种治疗丙型肝炎的核酶药物导致猴子失明，可能是大剂量注射所致。另一个核酶药物看上去并不能在晚期乳腺癌患者中减缓肿瘤的生长。当时公司只剩200万美元的现金并面临被从纳斯达克股市中除名的危险，摆在新任首席执行官Howard W. Robin面前的是停业。在这最黑暗的时刻恰好赶上了Tuschl发表RNAi的论文，于是发生了戏剧性变化，不是关门停业，而是Ribozyme公司变为Sirna Therapeutics公司。Sirna公司重新调整了它曾用于核酶给药和稳定药效的制药技术，将其应用于siRNA研发之中，最终Robin宣布该公司单剂量的siRNA在活体动物细胞内能维持22天的活性。并且改组后的Sirna Therapeutics公司18个月内成功的吸引了7200万美元投资。除了老年性黄斑退化病，该公司还计划开发治疗肝炎、肿瘤和Huntington舞蹈病，以及其他疾病的siRNA药物。对公司的这段经历，Robin认为“从一项并不完善的技术中建立知识产权并将其应用于生物学最热门的领域中并不常见，”。

Sirna公司已申请了90种专利，Robin相信它们涵盖了大多数前景诱人的药物。Robin声称“如果你观察一下我们的竞争对手，我们相信几乎他们所做的每一件事都侵犯了我们的专利”，Maraganore对此略有微词：“我们会对使用任何有关siRNA专利而付费”。专利的争夺战会随着技术更接近于市场而迫在眉睫。但在siRNA药物更加接近于被批准以前任何的争辩都不可能公开。在此期间，研究者会进一步观察是否siRNA会产生有害的免疫应答或关闭那些他们期望完整保存的基因。

目前，对RNAi的乐观情绪占主导地位。“如果你于人体中进行在培养细胞中所做的有关RNAi的工作，你要有难以置信的强大技术来制造药物，”Maraganore说。“有选择地并有效地沉默基因是药学的梦想，”Robin声称。但Isis公司的Crooke被其公司的几个反义药物的实验失败锤炼过，他有一个稍有不同的观点：“不管什么时候只要你认为一些东西是不可思义时，你将陷入困境。RNAi是一个拥有许多有趣的细微差别的复杂系统，该系统自然会导致一些意想不到的结果，但可能除了你所期望的外”。

RNAi在相当短的时间内成为一个卓越的研究工具，但作为一个以基因为基础的药物，当第一个临床实验还不能证实是否一次简单地注射就能关闭致病基因的影响时，RNAi的潜力在几年内还不会很明晰。

丁坤善/译

王芷/校