互动科普

共焦显微术

Jeff W. Lichtman

在产生清晰的两维或三维光学图像方面，这种显微技术是无与伦比的。它也可以用于观察活体样本的深部组织。

Marvin Minsky以人工智能之父而著称于世，但他还曾是另一项非凡成就的主人。在50年代，他在哈佛大学作博士后的时候，他制作了一架与众不同的光学显微镜，利用这架显微镜，他可以不必费劲地把样一本切成薄片，就能十分清晰地连续观察样本的深层。Minsky的发明在当时并没有得到广泛关注。事实上，当他在1961年为他的“双聚焦分级扫描显微镜”请专利时，没什么人懂得它能作什么用。在这项专利的17年的有效期中，他没收到一分钱的专利费，也没有生产过一件设计上类似的仪器。由于其成果在光学界没人识货，Minsky便转移到其他研究领域，他那架原型机只能默默无闻地在地下室角落里生锈。

三十年后，他的方法——又被称为共焦显微术——受到了人们的关注。事实上，这项技术被证明是本世纪光学显微术的一项最激动人心的进展。现在还不完全清楚，重新发现Minsky的早期工作或者其他人独立地重新发明Minsky的概念，究竟在多大程度上激发了当前的兴趣。然而，有几十种不同类型的共焦显微镜现己面世，有基本型的，也有复杂的。这些成果令人鼓舞。无论研究人员需要拍摄土豆片或计算机芯片的超微结构，还是患病的眼球或发育中的大脑，共焦显微术都使他们能以新的方式原原本本地看到样本。

Minsky多年来一直在麻省理工学院工作，他是在考虑人类大脑是如何工作的过程中开发出这项技术的。他推测，如果大脑中所有神经元的联系都能作图记录下来，这样的一张线路图应能揭示大脑动作的本质。可惜的是，任何试图用传统的光学显微术来鉴别一片大脑组织中神经细胞之间细微联系的人，立即会遇到一个严重的技术障碍。

在标准的显微镜上，放大透镜或透镜系统（通常称为物镜）都要照亮样本，从而提供了一个样本的图像。当物镜将光线聚焦到脑组织（或任何厚的半透明材料）表面之下的平面上时，图像马上变得摸糊了。要想看清这种组织深处的神经单元，恰似想打一下闪光灯就要看清泥潭表面之下的一件东西。光线被如此众多的小颗粒所反射，以致无法将那件东西与它周围的环境相区分。

为了完美清晰地呈现一个样本中的单独一个平面。理想的状况是收集到直接来自所感兴趣的那个平面的反射光，而且仅仅是那些光。然而该平面上下的材料也要反射光线，就造成了模糊，于是光学显微术就一筹莫展了。与此同时，一种叫做散射的麻烦现象能降低图像的反差。散射的产生是因为光线射在小颗粒上后，在到达探测表面之前又被反射到另外的颗粒上。这样随机地偏转的光线所产生的信号不能传达什么有意义的信息。它们产生了一片漫射光，淹没了从感兴趣平面反射回来的光。

通过对标准显微镜只作几处改动，Minsky成功地把模糊作用降到了最低程度，并增强了反差。首先，他防止了大多数散射作用的产生。他让照明用的光线通过一个物镜，该物镜把光线聚焦成一股沙漏计时器形状的光束。然后他把光束的“腰”——一个明亮清晰的光点——对准样本某一深度上的一点。这一过程使得那一点成了样本上被照得最明亮的地方，从而也就会反射最多的光线。同样重要是，通过聚焦到一个点上，Minsky保证了样本上的其余材料不会有光线照到并散射。在传统的显微镜上则相反，整个样本都被照亮，都能随意偏折照明光线。

在小面积上聚焦光线的策略限制了散射光的总量，但它并不能阻止在感兴趣的亮点上下那些被照亮组织（在沙漏状光束之内）反射和散射光线。通过第二个关键性的调整，Minsky得以阻止这些局外的光线到达探测表面。他知道，物镜把从照得非常明亮的光点返回的光线聚焦到远高于样本之上的一个平面。在这个平面上，他设置了一个带针眼孔径的掩蔽罩，孔径的位置使返回光线能通过它到达探测表面。效果是很显著的：从样本上照得非常明亮的光点所传来的所有信号都通过孔径到达了探测器上。与此同时，掩蔽罩把光点外组织上所发射来的光几乎都挡住了。结果便形成了这一光点的近乎完美的图像，它几乎没有受到散射光的干扰，也没衣受到非聚焦区域来的光的干扰。

Minsky的头两步改进有一个明显的问题，那就是它们所得到的图像虽然清楚，却只是一个很小的光点。为了充分表征一个完整平面的全部特色，这位年轻的发明家再加上了最后一步：扫描。他在一个平面上按照光栅形式一行接着一行一点一点地移动样本，于是在某一特定深度上的每一个点最终都经过强烈聚焦的照明光束，并依次通过针眼孔径向探测器传送了一个清楚的信号。他操纵样本所用的是两把电磁音叉。一把叉让样本在每一行上横着移动，另一把叉让样本从平面上的一行移动到下面一行。

为了看到一个平面的完整图像，Minsky让光线通过孔径投射到一个光电倍增传感器上。这个传感器随即便产生一条电信号流，这些信号在一台长余辉雷达荧光屏（军队剩余物资）上产生一个图像。通过把物镜降低或抬高，并重复扫描过程，他能够在雷达的大荧光屏上观察样本的另一个平面，选用一个大荧光屏很可能是一个战术错误。当Minsky邀请哈佛的同事朋友们来观看他的发明时，他们往往难以说清究竟所见为何物。正如Minsky后来推断的那样，所显示的图像展开得太大了。

在1988年的一篇报告中，Minsky说，“我向许多来访者演示了共焦显微镜，但他们对于在雷达荧光屏上所见到的。都没有留下什么印象。只是到了后来我才明白，一架显微镜光是有很高的分辨能力是不够的，还必须让图像看起来清晰。也许为了实现最大的视觉能力。人的大脑需要一定程度的视网膜中央凹压缩。无论如何，我该用胶片，或者至少装备一个较小的荧光屏!”，这两件事他都没有去做，也许正是这个原因，共焦显微术被冷落了几十年。

尽管在早期人们对共焦显微术不感兴趣，但研究人员和制造商还是设计了许多方法来综合共焦显微术的一些基本特性，即只照亮样本的很小区域，通过与照亮区域准直的孔径来传送反射光线，以及对样本进行扫描。几乎没有一种设计是让样本移动的，大多数装置都是让光束移动。为了增加获得图像的速度，有些显微镜用绕轴旋转的镜子来移动光束，迫使入射的光线以一种光栅扫描的方式迅速扫过一个样本。这些镜子使得显微镜能在不到一秒钟的时间内重构一幅图像。这种显微镜要求比Minsky的显微镜有更强的光源。无论如何，它们必须马上从每个样本点产生一个可探测的信号。为此，广泛地探索了激光在共焦显微术上的应用，因为激光强度极高，而且很客易聚焦成一个小点。

另一个节省时间的策略是利用多个光点同时扫描一个样本的不同区域。很像并行计算机在同一时间执行不同运算一样。有些这种设备还装有带许多孔径的旋转圆盘，照明光和反射光都从这些孔径通过。有些仪器利用狭缝形孔径来代替针眼孔径，这样就能照亮一条线，而不仅是一个点，从而缩短了扫描时间。快速扫描法能够做到实时观看一个样本的整个平面，而且往往是直接通过目镜来观看的。

另一项革命性进展使得大多数现代的共焦显微镜受益无穷：开发出了执行数字化图像处理任务的计算机。当一架共焦显微镜连续扫描一个样本的各平面时，它产生了大量的图像，每幅图像都是一个光学截面，这种截面与实际上从样本上切下来的小片组织的图像相似。图像处理程序不但记录每光学截面中每一点亮度，而且还记录了该点在样本中的位置——它在平面中的位置（它的x轴与y轴）以及它的深度（它的z轴）。由三个坐标定义的点称为体素，它们是二维图像中的像素在三维上的对应物。

图像处理程序能够把体素汇编成显微物体的三维重构图。它们还能很轻易地操纵体素，让重构围绕着一个轴旋转，以便从任何理想的角度来观察。这样一项技术的发明使得科学家们很容易观察那些用其他手段来观察又费钱又费时的现象。例如，研究大脑的工作者发现，配备有计算机的共焦显微镜在揭示神经系统细微结构上特别有用。他们正着手利用这些设备观察活动体脑组织。从十分基本的起点开始，共焦显微术已发展成为综合了激光、光学、电动扫描和计算机图像处理等学科的极其复杂的技术。这一成果使得显微科学家能随心所欲地对物体作深入观察，并做出多维图像。Minsky利用显微术来绘制大脑电路图的梦想看来终于趋于实现了。

 【王世德/译；郭凯声/校】