互动科普

一名患有白血病、十多年来HIV检测一直呈阳性的患者，通过骨髓移植，不但白血病被治愈，其HIV也消失无踪。科学家发现，也许是一种“入口蛋白”的缺失，成就了“柏林病人”这个艾滋病治疗史上的奇迹。能否找到更安全、更普及的方法，关上HIV入侵的大门，使数百万艾滋病患者受益呢？

撰文 卡尔·琼恩（Carl June） 布鲁斯·莱文（Bruce Levine） 翻译 李凌宇

这个好消息的确让人难以置信。这位被称作“柏林病人”的患者后来公开了身份，他是美国加利福尼亚州的蒂莫西·雷·布朗（Timothy Ray Brown）。此后5年里，尽管一直没有服用任何对抗HIV的抗逆转录病毒药物（antiretroviral drug），但他没有表现出任何感染了HIV的迹象。过去几十年中，4 000多万人感染了HIV，到目前为止，布朗是唯一有据可查、彻底治愈的患者。

由于诸多因素，这种治疗方法目前还无法推广——其中一个重要原因是，这种疗法的第一步，就是摧毁患者自身的免疫系统，这种做法风险相当大。然而，这个让人意想不到的成功案例还是激励了世界各地的研究者去寻找更安全、成本更低的方法，给患者构建一套全新的、足以抵御HIV的免疫系统，就像布朗所获得的那样。利用这种方法，医生能够关闭HIV的入侵之门，阻断HIV在细胞间的传播扩散。经过改造的免疫系统，最终还会把潜伏在身体各处的病毒一一清除。新的艾滋病疗法将不会像传统疗法一样，仅仅是抑制人体内的病毒，而是效仿“柏林疗法”——如果取得成功，将彻底清除病毒，并且极有可能治愈艾滋病。

实际上，我们认为，为艾滋病患者构建一个与“柏林病人”类似的、能使其康复的免疫系统，可能存在一种更简单易行的方法。从实验室研究的进展来看，我们的方法非常有希望，目前正在一些HIV感染者中开展早期临床实验。当然，我们还有很多工作要做，还不能确定这种治疗方法是否有效，但“柏林病人”摆脱HIV的实例，以及我们的初步结果让我们相信，我们正在建立的治疗方法会改变数千万HIV感染者的人生。

调节免疫系统

我们改造患者的免疫系统、使其抵御HIV的治疗方法，面临着两大挑战：一是弄清楚如何加强免疫系统来对抗HIV；二是找到合适的方法，阻止HIV入侵它们最喜欢的CD4+细胞，也就是辅助性T细胞（helper T cell）。这些特殊的T细胞在免疫反应中所起的作用，就像橄榄球比赛中的四分卫（quarterback），会协调各种免疫细胞之间的相互作用。HIV最初感染辅助性 T 细胞时，不会造成任何实质性的危害。而在这之后，当免疫细胞被激活，去对抗病毒感染时，被感染的T细胞就会释放出更多的 HIV拷贝。更不幸的是，HIV最终会杀死这些起协调作用的T细胞，使免疫系统衰竭，以至于对其他类型的感染也无力还击。通过这种作战方式，HIV选择性地清除了免疫系统中的“精英分子”。在这些“精英分子”减少的同时，身体抵抗外界感染的能力也随之下降。最后，这一致命感染的终极阶段到来——艾滋病发作。

增强人体免疫系统是很难做到的，更别说保护辅助性T细胞了。然而，当“柏林病人”的消息传出时，我们才发现，这两方面都有了进展，尽管这是各自独立的两个研究方向。

多年来，研究癌症和病毒感染的科学家一直在探索激活免疫系统的方法。比如，从患者身上取出T细胞，用某些物质刺激它们，使之增殖，并对癌细胞或病毒具有更强的抵抗力，然后把这些细胞输回患者体内。20年前，我们两人就在沃尔特·里德国家海军医疗中心（Walter Reed National Military Medical Center）展开合作，开始做这方面的研究。根据美国弗雷德·哈钦森癌症研究中心（Fred Hutchinson Cancer Research Center）的菲利普·格林伯格（Philip Greenberg）和斯坦利·里德尔（Stanley Riddell）、贝勒大学医学院的马尔科姆·布伦纳（Malcolm Brenner）和克里昂纳·鲁尼（Cliona Rooney）等人的研究，我们着手改进体外培养T细胞的方法。那时，在实验室中培养来自捐献者的T细胞，只能使用含有多种化学信号分子的复杂培养基，或者从捐献者的血液中提取另一种免疫细胞——树突状细胞，这种细胞可以引导T 细胞走向成熟，大量增殖。

当时，我们提出了一个想法：通过人工仿制树突状细胞，来简化T细胞的体外培养过程。我们以一些比T细胞略小的磁珠为原材料，将两种蛋白黏附到磁珠表面上，来模拟树突状细胞表面的分子。当把这些磁珠与T细胞一起放到培养瓶中培养时，我们发现，这些磁珠能非常有效地发挥作用：大概每隔两周，我们会重新放入一些磁珠，那些活化的T细胞似乎非常“享受”，一直在增殖，在两个多月里，它们的数量增长了将近一万亿倍。

随后，我们采集了HIV检测呈阳性的自愿者的血样，用以检验上述方法的有效性。结果，我们惊奇地发现，我们培育的T细胞能明显抑制HIV的感染进程，尽管只是暂时性的。1996年6月，我们发表了这一结果，但那时我们也不清楚，磁珠法培养的T细胞对HIV的抵抗力为何会增强。不过，就在那年晚些时候，一个重要线索出现了，最终帮助我们解开了这个谜团。

HIV入侵之门

当我们在建立T细胞的培养系统时，其他研究者发现了HIV攻击方式的一个重要破绽。艾滋病刚开始流行时，研究人员就已发现，少数人对HIV具有极强的抵抗力，即使他们曾经多次接触HIV。1996年底，很多研究机构发表了有关HIV的研究，其中有几家实验室同时报道了一种叫做CCR5的特殊蛋白，这种蛋白位于辅助性T细胞等特定细胞的表面，它们就像一个细胞入口，HIV通过这个入口便可侵入T细胞。更重要的是，研究人员还发现，那些天生缺乏该蛋白的人不会感染HIV。

那些人之所以没有这种“入口”蛋白，是因为编码这种细胞表面蛋白的基因缺失了32个核苷酸（DNA组成元件，有A、T、C、G四种）。核苷酸的缺失，导致产生了一种缩短的、不能到达细胞表面的CCR5 蛋白。大约1%的高加索人遗传了两个有缺陷的基因拷贝，被称为CCR5-Delta32，因此他们的细胞对HIV感染有高度抵抗力。然而，在美洲土著人、亚洲人以及非洲人中，这种基因变异非常罕见。除了基因有些特殊，并容易感染西尼罗河病毒（West Nile virus）外，这些特殊人群似乎很健康。

只继承了一个CCR5-Delta32基因拷贝的人，仍然容易感染HIV，但对他们来说，从最初的感染到艾滋病晚期，整个疾病进程的平均时间要长一些。研究者已经发现，一种名为beta趋化因子（beta-chemokine）的天然化学信号分子可以阻断正常的CCR5蛋白，使HIV无法与CCR5结合。事实上，阻断CCR5正是一类抗HIV药物的作用原理。但是，要使细胞表面的所有CCR5长期结合着药物，使HIV无法侵入细胞，这是很难做到的。此外，HIV还可以通过变异来绕开药物封锁，它们稍微改头换面就可以通过CCR5“入口”侵入T细胞。

CCR5在HIV感染中所起的作用，有助于解释我们人工培养的T细胞为什么对HIV有抵抗力。磁珠激活T细胞的方法，会通过某种方式终止细胞中CCR5蛋白的合成。“入口”蛋白没有了，HIV就不能进入细胞。

基于这一点，我们开始考虑，是否可以把CCR5的相关发现，与我们新近改良的T细胞培养方法结合起来，创造一种全新的HIV疗法。这个想法促成了我们与克里斯汀·海格（Kristen Hege）、戴尔·安多（Dale Ando）的合作。当时，他们都任职于细胞基因系统工程公司（Cell Genesys，一家生物科技公司，总部在美国旧金山）。我们的初步合作是开展人体临床实验，检验T细胞的安全性——这些T细胞经过了基因改造，可以找到并攻击被HIV感染的细胞，我们还用磁珠培养法，让它们进行增殖。临床实验证明，这些细胞的安全性令人满意，注射到患者体内后可存活多年，但它们在抑制患者体内HIV的复制方面，效果并不明显。最终，细胞基因系统工程公司停止了该项目。

改造T细胞

2004年，也就是我们来到美国宾夕法尼亚大学几年之后，安多再次造访，提出了另一种实验设想。他也加盟了另一家生物公司——桑加莫（Sangamo），该公司刚刚研发出一项技术，可以在一个基因上选择特定位点进行切割。这种方法与其他方法有着本质的区别，效果也是其他方法望尘莫及的，因为利用这种方法，科学家能随心所欲地编辑某段基因序列。而在此前，哪个或哪段基因序列会被改变，研究者根本没法控制。

安多提到的这种技术，主要依靠两种蛋白来删除特定位置的基因片段。第一种是锌指蛋白（zinc finger protein），这是一类天然存在的蛋白分子，可以在基因转录（DNA信息转化为用以指导蛋白合成的RNA分子的过程）中与DNA结合。人类可产生大约2 500种锌指蛋白，每一种都只与DNA分子上相应的核苷酸序列结合。

经过多年研究，科学家找到了一种方法，可以人工设计、构建锌指蛋白，让它们结合到任何一段我们感兴趣的DNA序列上，比如编码CCR5蛋白的基因的某个片段。安多提出，由桑加莫公司首先构建一批锌指蛋白，可以结合到我们希望删除的那段序列的两端。然后，该公司的科学家会在这些锌指蛋白上添加第二种蛋白——核酸酶（nuclease），这种酶能够把DNA链剪成两段。最终，在这个复合体中，锌指蛋白会识别需要剪切的DNA片段，而核酸酶则负责将这个片段剪断。通过构建合适的锌指蛋白，桑加莫公司可以剪掉CCR5基因中的特定片段，而不会破坏其他基因。

编码CCR5蛋白的基因被专门设计的锌指核酸酶剪断后，细胞的修复系统就会启动：找到DNA断口，重新连接起来。不过在这个过程中，修复系统可能会丢失几个核苷酸，或者加入几个多余的核苷酸。因此，修复过程本身就能进一步确保，被剪断的基因不会产生正常的CCR5蛋白。

安多介绍完他的设想，离开我们实验室之后，总是极度乐观的琼恩对我说：“不错啊，这个方法可能可行！”是的，确实值得一试。除了能特异性地删除CCR5基因的部分片段，锌指核酸酶本身就很吸引人，因为这些蛋白只需要很短的时间就可以起作用，而且在细胞中不留任何残迹。

 “柏林病人”振奋人心

当我们获得了美国食品及药品管理局（FDA）和国立卫生研究院（NIH）的许可，可以进行早期临床实验（对人体的安全性研究）时，“柏林病人”被成功治愈的消息传来了，这使我们更加相信，向患者注射CCR5基因发生变异的T细胞，能有力打击患者体内的HIV。在一篇报告中，杰罗·胡特（Gero Hütter）及其同事详细描述了这个一生可能只遇得到一次的研究。他们有一个患者（即“柏林病人”），感染HIV已十多年，一直在服用抗病毒药物，效果还算不错。但是，他又患上了一种与HIV感染不相干的疾病——急性骨髓性白血病（acute myeloid leukemia）。他接受过化疗，但白血病再次复发。如果不进行骨髓移植，利用他人的骨髓，在该患者体内重建一个免疫系统（包括所有类型的T细胞），他很快就会死去。

胡特在欧洲骨髓库中寻找可能的骨髓捐献者——捐献者的人类白细胞抗原（human leukocyte antigen，HLA，免疫系统用来区分自身组织与外来组织的一类蛋白）要和患者的相匹配才行。骨髓移植中，捐献者和接受者的HLA配型一致是非常关键的，这样才不会出现移植物抗宿主病（graft versus host disease），即移植来的细胞将新宿主视为外敌，并对宿主组织发起攻击；同时也能避免患者以前的免疫系统残留下来的细胞引起排斥反应。

然而，胡特并不仅仅满足于HLA配型一致。他希望找到某个捐献者，不仅HLA匹配，而且天生具有两个拷贝的CCR5-Delta32变异基因。用这样的捐献者提供的骨髓进行移植，很可能会给HIV检测呈阳性的接受者带来一个全新的免疫系统，能持续抵抗HIV的入侵。

令人惊讶的是，胡特搜索完数据库，并对超过60个可能的捐献者进行基因检测后，居然找到了一个完全符合条件的人（这种搜索极为复杂，因为HLA变化多端，人与人之间通常不一样，而且HLA基因与CCR5基因位于不同的染色体上）。能找到这样的捐献者实在是幸运，因为只有极少数人的两个CCR5基因拷贝都存在CCR5-Delta32变异。更幸运的是，“柏林病人”的HLA配型也较为常见（全世界的研究者都试图重复这个实验，但是迄今为止，谁也没找到HLA配型符合要求、并且带有CCR5变异基因的人，这应该能让大家明白，这个案例中的组合特征有多么罕见）。

最后，“柏林病人”接受了两次骨髓移植来治疗白血病。引人注目的是，做完移植手术五年多后，他一直没有再服用抗逆转录病毒药物，但医生在他的血液、肝脏、肠道、大脑、淋巴组织及血浆中，都没有检测到HIV，即使用目前最灵敏的分子检测手段也是如此。没有人知道HIV是否真的从“柏林病人”的所有组织中消失，实现了所谓的“彻底根治”（sterilizing cure），因为HIV可以把自己的基因插入各种细胞的染色体中（参见《环球科学》2008年12月之《艾滋病能治愈吗》），从而可以在人体内潜伏很多年。还有一点无法确定的是，如果他现在的免疫系统可以迅速处理以后可能出现的HIV感染，也就是说如果他被“功能性治愈”（functionally cured，即患者体内仍有少量HIV，但免疫系统能控制它们，不对患者造成伤害，从而不需要再进行持续性治疗），那么，还有没有必要彻底消灭他体内的所有HIV呢？不管怎么说，这个患者不再需要服用抗逆转录病毒药物，而且在他体内也检测不到病毒的存在（当然，他还是需要服药，以维持骨髓移植的效果）。

令人遗憾的是，未来几年的研究可能会证明，“柏林病人”是用骨髓移植治愈HIV感染的唯一案例。一方面，拥有合适的HLA配型及基因变异的捐赠者和接受者非常罕见；另一方面，这项特殊治疗的费用非常高（在我们的医院，骨髓移植至少需要25万美元），同时患者还要接受高强度的化疗、高风险的骨髓移植以及终身服用抗免疫排斥药物。事实上，“柏林病人”是用另一个难题——骨髓移植，来解决当前面临的难题——HIV感染（及白血病）。对于大多数HIV感染者来说，只要服用抗HIV药物，就可以过着还算健康、丰富多彩的生活（虽然会有明显副作用，为此付出寿命缩短的代价），因此如果他们面临这样的选择，肯定会犹豫不决。当然，“柏林病人”患上了致命的白血病，他别无选择。

尽管柏林的这个成功案例让我们备受鼓舞，但我们也意识到，捐献者免疫系统中CCR5蛋白的缺失，可能不是“柏林病人”摆脱HIV的唯一原因。或许，潜伏在该患者体内的HIV，因为他多年来坚持服用抗逆转录病毒药物而消耗殆尽；也有可能是，患者接受骨髓移植时，原来的免疫系统被破坏后，就没有HIV残存下来；又或者，骨髓移植引发了移植物抗宿主病，在受到药物控制之前，这种排斥反应消灭了患者体内残留的、被HIV感染的细胞（除了同卵双胞胎，任何两个人的HLA都不可能百分之百匹配）。不过，CCR5蛋白的缺失仍然是骨髓移植治愈HIV感染的最佳解释，因此，我们急切地开始了自己的实验。

临床实验正在进行

当“柏林病人”的消息传来时，桑加莫公司已经按照约定，构建出了一批锌指核酸酶，它们的切割点位于CCR5基因最关键的32个核苷酸序列附近（我们的目的是让CCR5蛋白失去功能，因此没必要与自然发生的基因变异完全一致，只要产生的蛋白没法充当HIV“入口”即可）。在此之前，我们与实验室的博士后研究员埃琳娜·佩雷斯（Elena Perez）一起，已经发现了一个颇具讽刺意味的事实：HIV感染本身居然有助于重塑免疫系统，使免疫系统对HIV的抵抗力更强。我们的实验证明，即使那些利用锌指核酸酶构建的、CCR5基因经过切割的T细胞，最初在培养体系中只占很低的比例，但一旦遇到HIV，它们就会不断扩充，稳定T细胞群体的数量；相反，没有经过改造、仍然含有CCR5蛋白的T细胞则被HIV摧毁。换句话说，HIV杀死了那些脆弱的T细胞，同时也留下越来越多的CCR5蛋白具有缺陷的T细胞，而正是这些细胞对HIV具有抵抗力，可以承担起免疫细胞的重任，保护机体免于受到HIV感染。

在人体安全性实验中，我们得到的初步结果也让人鼓舞。2009年夏天，美国费城，在我们这项临床实验的负责医生巴勃罗·特巴斯（Pablo Tebas）的指导下，第一个患者接受了CCR5蛋白经过改造的T细胞的回输。从那时起，又有11名HIV阳性的自愿者接受了该疗法（此研究项目由NIH资助）。桑加莫公司在西海岸也发起了类似的安全性实验。尽管从本质上说，这些安全性实验并非用来证明治疗是否有效，但在所有患者的血液检查结果中，我们还是观察到，辅助性T细胞的总数已经超出基线，开始上升，这说明治疗很可能起到了保护T细胞的作用。另外，在血液和肠道淋巴组织中，我们还检测到CCR5蛋白失去功能的辅助性T细胞（这些细胞只可能来自那些被锌指核酸酶改造过，然后重新移植到患者体内的细胞）。

下一步就是测试这些经过改造的免疫细胞，能否有效打击体内的HIV。为此，我们采用了一种比较有说服力，但又有点让人担心的实验方法。在医生的严密监测下，我们让自愿者停止服用抗HIV药物，然后观察会发生什么。其中一个接受了治疗的自愿者，遗传有一个拷贝的CCR5-Delta32基因（这给他带来了一点先天优势），他停止服药12周后，我们没有在他的血液和淋巴组织中检测到HIV。后面接受治疗的患者，目前还处在注射后的疗养及后续观察阶段，再过一年，我们会完成对这些患者的调查。另外，我们还筹划了其他的临床实验，来检测这种新疗法的功效。如果我们最终能够成功，这种锌指核酸酶疗法不论与罕见的CCR5缺陷型骨髓移植相比，还是与终身服用抗HIV药物相比，费用都要低很多。

就在几年前，创建安全、有效、廉价的抗HIV疗法，让患者不依赖药物即可长期控制HIV感染的想法，还是一个幻影，绝大多数人甚至连想都不敢想。即便我们专门设计的锌指核酸酶最终无法治愈HIV，我们仍然坚信，在过去30年中，它可能是最接近将HIV关在“细胞大门”之外的治疗方法。