互动科普

干细胞的一项创新性应用可能会加速药物开发，用于治疗某些绝症。

在培养皿中制造疾病

撰文 史蒂芬·S·霍尔（Stephen S. Hall）

翻译 雷荣悦

2007年6月26日，美国哥伦比亚大学临床遗传学项目负责人张文迪（Wendy Chung）带着一个小小的请求，驱车前往纽约市皇后区拜访了一个不幸家庭中的克罗地亚裔妇女。这是一对姐妹，年龄分别为82岁和89岁，张文迪问她们是否愿意捐献一些皮肤细胞，用于一项雄心勃勃、极具不确定性的试验。如果试验成功，肯定会有双重回报：第一，两姐妹的家庭被一种尚无法治愈的疾病困扰，而这项试验的成功会加快科学家寻找相应疗法的进程；第二，这项试验可能会开拓出干细胞（可分化为多种人体细胞的未特化细胞）的一种极有价值的新用途。“我们吃完一顿丰盛的午餐后，直接回到屋子采集了活组织样本，”张文迪回忆道。82岁老人的女儿也回忆说，他们还坐在餐厅的桌边时，这对老姐妹就“非常高兴地伸出了胳膊”。妹妹对张文迪说：“我懂了，开始吧。”

困扰这对姐妹的疾病是肌萎性脊髓侧索硬化症（amyotrophic lateral sclerosis，ALS，又被称为渐冻症），这是一种退行性神经疾病，会让患者逐渐瘫痪。1939年，美国纽约扬基队的棒球明星卢·格里格（Lou Gehrig）被确诊患有这种疾病，两年后就去世了，从此这种疾病就多了一个名称：卢·格里格病。上文的两位姐妹中，89岁的姐姐几乎没有出现什么症状，而82岁的妹妹连走路和吞咽都很困难。

虽然大多数ALS病例都不具有遗传性，但这个特殊家庭的多个成员已经患了这种疾病。患病成员遗传了一个基因突变，凡携带这种突变的人，患ALS的发病进程要比其他患者更慢一些。张文迪一直在欧洲和美国追踪已在家族中遗传了数代的ALS病例。“卢·格里格病不是一种体面的死亡方式，”她说，“每次这些家庭的成员在葬礼上聚在一起时，那些年轻一代就会暗自担心：‘我会不会是下一个？’”

张文迪仅花了两分钟，就完成了真正意义上的“钻取活检”（punch biopsy）——在姐妹俩的手臂内侧迅速挟去两块直径为3毫米的皮肤。最终，她们的细胞和其他几十名ALS患者及健康志愿者以类似方式捐赠的皮肤样本，经过化学诱导，变成了一种干细胞（即诱导多能干细胞，induced pluripotent stem cell），并通过重编程分化成了神经细胞。具体来讲，它们被诱导成了运动神经元（motor neuron）。在人体内，这类神经元直接或间接地控制着人体肌肉，而ALS会对它们造成不可逆的损害。在分子层面上，由诱导多能干细胞形成的组织培养物与细胞捐赠者具有同样的缺陷。换句话说，科学家做了一件让人震惊的事情：在培养皿里制造出了ALS。

有了这些细胞，科学家就可以开始研究ALS患者的神经细胞究竟出了什么毛病，还能着手筛选对病变细胞可能有效的药物。这是对干细胞的创新性使用，与干细胞疗法相关研究的迟滞不前形成了鲜明对比。如果这项研究获得成功，在培养皿中制造疾病的方法可以加快科学家对多种疾病的研究，帮助他们更快、更有效地筛选潜在药物，因为在专门定制的某种培养物上，科学家可以同时测试潜在药物的疗效和毒性。除了ALS相关研究，诱导多能干细胞还被用于构建数十种疾病的实验模型，比如帕金森病、镰状细胞性贫血和其他多种血液疾病。德国科学家已经制造出了无规律跳动的心肌细胞，可模拟各种心律失常。一直把干细胞科学看成香饽饽的制药公司也开始对此表现出更浓厚的兴趣，因为在培养皿中制造疾病的方法是商业化药物传统开发技术的有效补充。

ALS试验的首个成果发表于2008年。与大多数创新项目一样，成功不仅取决于思路的可行性，还取决于科学家之间的良好合作。参与ALS试验的主要科学家除了张文迪，还有原来从事生物技术产业，现任哈佛干细胞研究所传统医学的负责人的李·L·鲁宾（Lee L. Rubin），以及来自哈佛大学不知疲倦的年轻干细胞科学家凯文·C·埃根（Kevin C. Eggan），而他又在与哥伦比亚大学的克里斯托弗·E·亨德森（Christopher E. Henderson）和其他运动神经元专家合作。

干细胞的新角色

诱导多能干细胞级技术的出现，使得在培养皿中制造疾病的想法变成了现实。

这些研究所使用的干细胞不同于从早期胚胎提取的胚胎干细胞（embryonic stem cell）。13年前，美国威斯康星大学麦迪逊分校的詹姆斯·A·汤姆森（James A. Thomson）和同事首次在实验室提取到人类胚胎干细胞，这条消息一经传出，全球为之震惊。这些原初细胞具有永久性的自我复制能力，能分化为人体内的任何一种细胞。从帕金森病到糖尿病，几乎可用干细胞为所有疾病的患者定制移植器官，这种可能性对医生、科学家、广大民众以及身患绝症的病人产生了巨大的吸引力。

但两个残酷的事实摆在面前。首先，干细胞研究的伦理问题在公众中引起了激烈的争论，使这一科学领域与政治牵涉在一起，严重阻碍了研究的进行。这门技术引起道德问题的原因是，科学家在提取干细胞时必然会破坏胚胎。2001年，这场争论达到了顶峰：美国时任总统乔治·W·布什（George W. Bush）宣布，美国国立卫生院（NIH）将削减干细胞研究的经费支持，只会资助利用现有胚胎干细胞系进行的研究。这种做法使得科学家无法构建其他干细胞系，比如某些疾病特有的细胞系。作为回应，哈佛大学、哥伦比亚大学和斯坦福大学的杰出研究团队以及ALS项目、纽约干细胞基金会之类的病患支持团体，创立了独立的“非总统”实验室，寻求私人资金继续进行研究。2009年，奥巴马政府放宽了对干细胞研究的管理，但在2010年，美国联邦法院的一次裁决再次禁止NIH拨款资助干细胞研究，使这一领域的科学前景变得极不明朗，资金来源也很混乱。

第二个问题来自于科学层面。ALS项目的科学主管瓦莱丽·埃斯特斯（Valerie Estess）回忆说，当时科学界掀起了一股热潮，大家争相去验证这样一个设想：把干细胞分化而成的细胞直接移植到病人（或动物）体内，作为细胞疗法治愈多种疾病。她解释说：“我们最想实现的梦想是，诱导干细胞分化成运动神经元，把它们放进大脑或脊髓，病人马上就可以站起来跳舞。”但在一次又一次的动物实验中，这一设想始终没有变成现实。“由始至终，”埃斯特斯说，“就没有一个实验成功过。”

2002年，哥伦比亚大学的托马斯·M·杰塞尔（Thomas M.Jessell）、希内克·维奇特勒（Hynek Wichterle）和他们的研究团队在《细胞》杂志上发表了一篇里程碑式的论文，阐明了胚胎干细胞沿着一条生物途径分化成运动神经元所需的成分和步骤。从这项研究中，鲁宾看到了干细胞的一项新用途。聪明而活力十足的鲁宾曾接受过神经科学训练，现任马萨诸塞州Curis生物技术公司的首席科学官。他意识到，在培养皿中构建一种疾病模型，提供了一种可能具有革命性的药物开发方法。与很多学院派的科学家不同，他对药物开发有一些了解。鲁宾还在生物技术领域时，他曾研究过一个分子，最终变成了市场价值达到10亿美元的多发性硬化症药物Tysabri。

获知杰塞尔和维奇特勒的研究结果后，鲁宾草拟了一份创建新型干细胞研究所的商业计划。他说：“这个研究所不会去关注所有干细胞生物学家都感兴趣的细胞疗法，而是利用干细胞来开发药物。”那时，风险投资者对这个想法不感兴趣。因此，鲁宾只好靠着Curis公司艰难维护这个想法，对一种病理机制与ALS相似的儿童运动神经元疾病——脊髓性肌萎缩症进行研究。2006年，Curis公司决定终止这个项目时，鲁宾离开了生物技术领域，前往哈佛大学干细胞研究所继续追求在培养皿中制造疾病的梦想。

就在鲁宾转向干细胞研究后不久，一位名叫山中伸弥（Shinya Yamanaka）日本科学家发明了一种技术，从根本上改变了干细胞生物学以及干细胞研究备受争议的局面。2006年3月，在加拿大不列颠哥伦比亚省惠斯勒召开的一个科学会议上，这位来自日本京都大学的科学家讲述了一种方法，生物学家可以通过它，对哺乳动物的普通成熟细胞进行“重新编程”。大体上讲，山中伸弥是借助生化手段，让成熟细胞重返类似于胚胎细胞或干细胞的状态，而无需使用或破坏胚胎。他将这些细胞称为“诱导多能干细胞”（iPS细胞）。一年后，山中伸弥和汤姆森分别报告称，他们用人类组织制造出了iPS细胞（参见《环球科学》2010年第6期《干细胞治疗 用你的细胞定做器官》）。

埃根当时就坐在惠斯勒科学会议的听众席上，这位来自哈佛大学的细胞重编程专家其实已经开始按自己的想法在培养皿内构建疾病模型。他发起了好几个项目来采集成熟人体细胞，通过生化技术进行诱导，使细胞返回胚胎样状态，让它们自我复制，最后从得到的细胞集落中提取干细胞。但他在制造胚胎样细胞时，使用的是一种老式方法，也就是当年培育多利羊的克隆技术。埃根首先要从一个成熟细胞中提取细胞核，然后把这个细胞核植入事先已去除细胞核的、未受精的卵子中。然而克隆的成功率非常低，而且极具争议，因为如果你要重编程一个人体细胞，你就必须找到愿意捐赠卵子用于克隆的妇女。

不过，利用山中伸弥的技术，埃根和他的团队终于在2007年夏天的一次试验中，把人体细胞转化成了诱导多能干细胞。在培养皿中构建疾病模型所需的所有条件都已经准备就绪。张文迪和哥伦比亚大学的同事已经收集了克罗地亚姐妹和其他ALS患者的细胞，这些细胞本来是准备用到埃根的克隆实验中。在私人的资助下，ALS项目已在哥伦比亚大学附近建立了一个专用实验室，患者捐献的细胞（包括克罗地亚两姐妹的）已在这里冷藏了好几个月。突然间，iPS技术使成功几率倍增。 ALS项目的埃斯特斯说：“完全是天意，我们开始收集人体皮肤细胞时，是在为另一个完全不同的实验做准备。”

在首批ALS细胞系中，最受关注的细胞是来自那对克罗地亚姐妹中病情更重的妹妹，她的代号是A29号患者。两姐妹的皮肤细胞都成功地被重编程为神经细胞，但A29号患者的年龄和病情能更好地说明，iPS技术完全可以制造出能够反映终身性严重疾病的细胞。“在研究中，我们之所以选择这些细胞样本，是因为它们来自年龄最大的患者，”埃根说。“我们想证明的是，即使一个人的年龄很大，而且已经病了相当长的时间，你仍然可以对他的细胞进行重编程。”

2008年8月29日，这项研究的结果在《科学》杂志上正式发表，被誉为干细胞研究的一个里程碑。利用干细胞在培养皿中构建疾病模型的策略，让科学家可以通过实验手段来获取通常情况下不可能得到的细胞：ALS和脊髓性肌萎缩患者的运动神经元、多种神经退行性疾病患者的脑细胞以及青少年糖尿病患者的典型胰腺细胞。

订制干细胞

科学家可以为不同的疾病制造不同的疾病模型。

过去两年里，哥伦比亚大学与哈佛大学的科学家合作，已经制造了30多种人类ALS细胞系，还有更多的细胞系即将产生。在这些细胞系中，很多都携带了发现于重症ALS患者身上的那种特有突变。更重要的是，在培养皿中构建疾病模型的方法已开始发挥潜力，让科学家可以更深入地认识运动神经元疾病的本质。利用克罗地亚姐妹的细胞，研究人员已经发现了一些可能与运动神经元死亡有关的分子途径。当这些神经元受到另一类神经细胞——星形胶质细胞（astrocyte）的毒性作用影响时，这种分子途径就会发挥作用。通过在一个培养皿中混合培养这两种神经细胞，科学家正在寻找可以抑制星形胶质细胞的毒性作用，或者提高运动神经元生命力的潜在药物。

2010年1月，ALS项目实验室的研究人员开始利用人类的ALS运动神经元，对大约2 000种化学物质中进行初步筛选，看有没有哪种分子能够延长携带了ALS突变基因的神经细胞的存活时间。这个初步的实验性项目展示了一种全新的药物筛选方案：ALS研究人员在寻找药物时，可以从已获得美国食品及药品管理局（FDA）批准的、用于治疗其他疾病的那些药物入手。如果运气够好，研究人员也许能找到一种人体安全性已得到证实的分子，很快就可以把它转变为治疗运动神经元疾病的药物。鲁宾就在哈佛大学用这种方法筛选药物，他已经找到了20几种小分子，它们能与新发现的那些分子途径中的某一种发生相互作用，增强运动神经元的存活能力。目前，脊髓性肌萎缩基金会（Spinal Muscular Atrophy Foundation）正在脊髓性肌萎缩的动物模型上测试鲁宾找到的一个分子。

iPS细胞为科学家提供了一个颇具前景的药物开发方法，最能说明这一点的是，鲁宾的研究不需要再依赖制药公司了。相反，自从2008年夏天，哥伦比亚大学和哈佛大学的科学家建立了在培养皿中制作疾病模型的工作原理，制造出具有A29号患者遗传特性的神经细胞后，一些制药公司就开始不断登门拜访鲁宾了。出于保密的原因，鲁宾没有透露是哪些公司，“我想说的是，几乎所有大型制药公司都对这种技术表现出浓厚兴趣”。这种技术的影响已经渗透到生物技术领域：包括埃根和鲁宾在内，很多参与了在培养皿中构建运动神经元疾病模型的科学家已经加入了总部位于美国加利福尼亚州“iPierian”生物技术公司，这家公司，以及美国国际细胞动力学公司（Cellular Dynamics International）和命运医疗公司（Fate Therapeutics），成为了最早将iPS技术用于药物开发的几家公司。

与此同时，越来越多的干细胞研究人员开始从事在培养皿构建疾病模型的研究。2008年，ALS研究的结果发表后不久，哈佛大学干细胞研究所的一个独立研究团队就报告说，他们从青少年糖尿病、帕金森病和其他疾病患者体内采集细胞后，利用iPS技术在培养皿中构建出了相应的疾病模型。2008年年底，美国威斯康星大学的克利夫·N·史文德森（Clive N. Svendsen，后来去了洛杉矶的西达斯－西奈医学中心）和同事一起，从一个脊髓性肌萎缩患者体内提取细胞，在培养皿中制造出了运动神经元。

当我问哥伦比亚大学和哈佛大学的研究人员，克罗地亚姐妹是否知道现在开展的研究都源自她们捐赠的细胞时，最初似乎没有人能回答。但我最后得知，这两姐妹都还健在，按照A29号患者女儿的要求，只要确保她和家庭成员匿名，她就同意说一些情况。现已93岁的姐姐现在仍然没有ALS症状，事实上，根据她的侄女描述，老人依然能够“独立生活，到处走动、购物、做饭和打扫清洁。”妹妹，也就是A29号患者，去年6月迎来了85岁生日，尽管受到ALS的影响，她仍然可以缓慢走动，而且为有机会提供帮助而感到“荣幸”。

不过，这个家庭的痛苦负担似乎并没有远去，那些可能从新的方法中获益的人们越来越感到形势的紧迫。“我相对年轻些，” A29号患者的女儿说，2002年她自己就被诊断出患有ALS。“我们担心这种疾病一代一代地遗传，发病会越来越早。”她停顿了一下，梳理了一下思绪：“这是与时间赛跑。我有一个十几岁的女儿，我很为她担心。”

图片：

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分化：干细胞在培养基（红色）中生长30天后，会分化成特化组织，可用于构建多种疾病模型。

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本文作者：

史蒂芬·S·霍尔在《长生不老》（Merchants of Immortality，2003年出版）一书中，描述了干细胞研究的早期历史。他最新的著作，《智慧：从哲学到神经科学》（Wisdom: From Philosophy to Neuroscience）在2011年3月出版。

干细胞的新用途

仍在等待：胚胎干细胞有望用于治疗绝症。然而到目前为止，科学家在干细胞疗法上一直没有取得进展。

新的想法：少数科学家认为，相对干细胞疗法，现阶段干细胞更适合用于药物筛选，以及用来探索各种疾病如何损害身体。

创新性技术：在以前的研究中，科学家所用的干细胞都来自胚胎。但在2007年，科学家能够将成熟细胞重编程为干细胞。

定制干细胞：科学家正在利用重编码的细胞在培养皿中去构建各种疾病模型，然后用这些模型去检测可能有效的药物。

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冷藏：活组织切片和干细胞被保存在液氮中

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1 定制步骤

2 老皮肤的新用途

3 运用日本科学家发明的新技术，美国哈佛大学和哥伦比亚大学的科学家从成人身上提取皮肤组织，分离出了名为成纤维细胞（fibroblast）的特化细胞，然后用基因和化学药品把这些细胞诱导成了神经细胞。

4 从一名ALS患者身上提取皮肤细胞。

5 研究人员把调控基因插入来自皮肤结缔组织的成纤维细胞。

6 调控基因

7 外源基因重编码成纤维细胞，生成可分化为多种细胞的诱导多能干细胞。

8 钻取活检

9 成纤维细胞

10 诱导多能干细胞

11 iPS细胞聚集在一起形成一些胚状体，科学家向其中加入两个信号小分子——视黄酸（retinoic acid）和一种刺激细胞分裂的物质。

12 信号分子

13 在信号分子的引导下，胚状体变成一个运动神经元。

14 胚状体 

15 运动神经元

16 培养皿中的病态细胞

17 候选药物

18 因为新制造的神经元来自一名ALS患者，所以细胞能表现出该病的病征。

19 细胞板用来筛选药物，每个孔测试一种药物，这样就可以同时筛选多种候选药物。

20 有前景的药物