互动科普

当罗伯特·海因岑（Robert Heinzen）刚开始试图让贝纳氏柯克斯体（Coxiella burnetii）自己生长时，惨遭失败。贝纳氏柯克斯体是一种病原体，可以导致症状类似流感的Q型流感。它通常可以在被感染的细胞中分裂，所以科学家不得不在哺乳动物的组织中培养它，这妨碍了对贝纳氏柯克斯体本身的研究。当海因岑在上世纪90年代初期进行博士后研究时，试图寻找一种不同的培养方法，但最后他得到的只不过是半本潦草的笔记。

不过这个问题一直困扰着他。直到2003年，贝纳氏柯克斯体的基因组测序完成，而海因岑也在美国国立卫生研究院落基山实验室有了自己的实验室。他认为，基因组可以提供关于细菌代谢和生长的重要线索。即便如此，他的博士后研究员安德烈斯·奥姆斯兰德（Anders Omsland）几乎花了4年时间，系统测试了数百种培养基组合后，才最终找到了在细胞外培养贝纳氏柯克斯体的完美配方。“当他给我看培养出的贝纳氏柯克斯体时，我想，这一定是被污染了，”海因岑回忆说。不过，随后几个月的工作确认了他们的成功。

但贝纳氏柯克斯体属于特殊情况。据估计，85%到99%的细菌和古细菌不能在实验室中培养，这极大地限制了科学家对微生物的了解，也阻碍了新抗生素的发现，因为一般来说，新的抗生素来自细菌。随着细菌对现有药物的耐受性越来越强，寻找抗生素的任务也变得紧迫。上个月，世界卫生组织通过了一项阻击抗生素耐药性的全球计划，而由英国政府成立的评审委员会呼吁，全球制药行业应为复兴抗生素研究投入13亿英镑（20亿美元）。为了寻找新药，研究人员表示，他们需要新的方法去研究那些没有培养过的微生物——这是微生物世界中神秘的暗物质。

科学家已经开始逐步完成这一目标。培养方法等技术的进步让他们可以在实验室第一次培养出某些微生物。而更先进的DNA测序和生物信息学技术可以让他们根本无需培养就能检测某些微生物。科学家从土壤、永久冻土层、海绵、海底热液喷口和人体皱褶中，找到了种类惊人的微生物，其中有些研究还指向了潜在的抗生素。但科学家表示，他们的研究仍然只是停留在表面。

“毫无疑问，我们很有可能发现更多的微生物，”德国维尔茨堡大学（University of Würzburg）的海洋微生物学家犹特·亨切尔（Ute Hentschel）说，“只要想找，就能找到更多的微生物。”

鸡尾酒培养法

通常，生物学家在研究微生物时，会在含有特定营养成分的培养基上培养细菌，但问题在于，在自然界中，细菌并非以这种方式生存：它们生活在极为不同的环境中，通常和其他物种生活在一起，而科学家很难模拟这样的环境。但是，正如海因岑和奥姆斯兰德对贝纳氏柯克斯体所做的研究证实的那样，基因测序可以提供一个解决方案。

奥姆斯兰德通过基因测序，比较了贝纳氏柯克斯体在宿主细胞中及单独生长时基因表达的区别。他发现，当生存环境不太好时，一些合成蛋白的基因的活跃程度会比较低下，这说明，在培养基中加入氨基酸和多肽可能有助于贝纳氏柯克斯体的生长和繁殖。但即使奥姆斯兰德将贝纳氏柯克斯体的蛋白合成效率提升13倍，它们仍然不会分裂。

来自基因层面的最终线索表明，贝纳氏柯克斯体可以在低氧环境中生存。当研究团队将其培养于含氧量低于5%的环境中时，他们终于看到细菌开始生长。“这是个非常重要的发现，”海因岑说，“含氧量并不是营养，而是一个环境因素。”

在使用了无共生培养（axenic，也就是没有宿主细胞的培养）方法后，贝纳氏柯克斯体的菌落开始扩大。研究人员可以选择性地打开或关闭基因，研究细菌如何与宿主细胞相互作用，进而入侵宿主细胞或开始分裂。“不夸张地说，无共生培养贝纳氏柯克斯体的方法给这一研究领域带来了一场彻底的革命，”澳大利亚墨尔本大学的微生物学家、贝纳氏柯克斯体研究者海莉·牛顿（Hayley Newton）表示。贝纳氏柯克斯体可以通过空气传播，是一种潜在的生物威胁。海因岑的实验室正在制造关闭了关键致病基因的菌株，希望它们有助于开发疫苗。

研究人员现在也在为其他只在细胞内部生长的细菌设计培养基系统。奥姆斯兰德现在正在华盛顿州立大学普尔曼分校（Washington State University in Pullman）工作。他为沙眼衣原体（Chlamydia trachomatis）发明了一套没有细胞的培养基系统，但是他还没能成功地让沙眼衣原体在这种培养基中分裂，而贝纳氏柯克斯体领域的成功给了他希望。

芯片实验室

使用微流体芯片可以帮助科学家更快开发出合适的培养基。微流体芯片上带有数千个与管道相连的微小凹槽，可以同时在上面开展很多实验。加州理工学院的鲁斯捷姆·伊斯马吉洛夫（Rustem Ismagilov）就用这种方法培养了一种新的微生物，他和同事甚至将这种微生物命名为isolate microfluidicus（意为通过微流体分离得到的细菌）。

2012年，一些微生物学家提出了一份“最想要”的微生物清单——他们希望科学界能培养这样的微生物：在人体内较常见、与已知基因序列的微生物亲缘关系较远，而且当时完全无法培养，他们还希望能测定出这些微生物的基因序列。当时，伊斯马吉洛夫已经在研究微流体了。

伊斯马吉洛夫和他的团队响应了这一号召。他们的设备上有很多小孔，每个小孔的容积为3 200纳升，整个设备可以放在手掌上。他们从一名健康自愿者的肠壁上刮取并稀释样品，让每个小孔里最多只有一个细胞。由于小孔数量很多，因此，研究人员就有较大的几率找到他们的目标——一种人体肠道微生物，属于颤杆菌克属（Oscillibacter）。至少，这种微生物会存在于几个小孔中。研究团队用了10块芯片，尝试了多种培养条件，并通过检测一个标记基因，观察这种微生物的生长情况。

研究人员找到了他们的目标细菌，并让这些细菌在培养皿中大量繁殖。这是那份“愿望清单”上最早被培养的微生物之一。进一步的基因检测表明，isolate microfluidicus并不是颤杆菌克属的一员，之前对它的分类有误，它应属于一种与颤杆菌克属有亲缘关系的新种。目前，研究团队正在研究isolate microfluidicus的特征。

研究团队发现，培养颤杆菌克属细菌的关键成分是从自愿者小肠中提取出的液体。伊斯马吉洛夫表示，微流体方法的一个重要优势是，可以利用一份宝贵的样本上，开展数千个实验。另一个优势在于，每个初始细胞都不用同其他种群竞争。他表示：“微流体可以让我们有效地找到合适的培养条件，让目标微生物有更大的繁殖概率。”

密歇根大学安娜堡分校的化学工程师林晓霞正用微流体技术在人体粪便样本中追捕“愿望清单”上的成员。微生物通常生活在复杂的群落中，并且经常依赖于其他物种。所以，林晓霞正尝试将两个、三个或四个细胞的无数种组合放在芯片上，从而研究它们之间的关系，弄清楚不同种类间的依赖关系。“这是一种很好的工程学方法，”正在帮助Lin获取临床样本的密歇根大学传染病研究人员文森特·杨（Vincent Young）说，“你能快速地降低复杂度”。

在自然界培养微生物

当斯拉瓦·爱普斯坦（Slava Epstein）和金·刘易斯（Kim Lewis）在15年前开始合作时，他们意识到也许不用“哄骗”这些倔强的微生物，让它们在实验室中繁殖。他们推测，如果细菌可以开心地在自然环境中生长，为什么不就在自然环境中培养它们呢？所以这两位美国东北大学的微生物学家开始发明一种可固定在地上的简单设备，并命名为iChip。

他们发明的方法在今年年初取得了成功。刘易斯和爱普斯坦在马萨诸塞州剑桥创办了创业公司NovoBiotic Pharmaceuticals。他们和这家公司的同事报告了自己的发现：利用iChip从土壤中分离出了新的细菌物种。iChip只有拇指那么大，比微流体芯片还简单：它有384个微孔，每个孔里都装满了混合了琼脂的土壤样本。样本经过稀释，每个孔最多只有一个细胞。iChip芯片被一层膜封好。这层膜不能让细菌离开芯片，但能让分子在膜内外来回扩散。芯片被安置在缅因州的草地里——芯片里的细菌样本就是在那里被发现的。

一个月后，研究人员将芯片中的细菌群落转移到实验室的培养皿里，然后从中提取样本，并筛查这些细菌的抗生素活性。他们培养了1万种细菌，这比直接把土壤样本放在琼脂培养基上的效果好很多。研究人员筛选出了一种新的微生物，将之命名为Eleftheria terrae，还发现这种微生物可以分泌抗生素teixobactin。在实验室里，teixobactin抗生素可以杀死多种感染人类的病原体，包括耐药性的金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）。美国洛克菲勒大学的化学生物学家西恩·布罗迪（Sean Brady）评论说：“对我来说，这是一个现象级的发现。他们可以从医药公司忽视的微生物种群中发现全新的分子。”

不过，引起轰动的是，研究人员发现其他细菌不会对teixobactin产生耐受性，这让teixobactin和一般的抗生素有了区别。这是因为teixobactin会结合在参与细胞壁合成的重要分子上，而目前为止还没发现细菌会修改这些分子，从而对抗生素产生耐药性。刘易斯说，研究表明，尽管E. Terrae天生可以耐受teixobactin，但在这类细菌中，似乎没有可以轻易转移到其他细菌中的耐药基因。虽然这并不意味着耐药性永远不会产生，但要产生耐药性，可能也需要20到30年。

NovoBiotic公司的团队正培养更多的细菌。他们正用发酵设备制造成克的药物，大范围地对这些药物和其他药物进行临床前测试，并从土壤和海洋样本中寻找更多没有被培养过的微生物。爱普斯坦正用iChip培养来自格陵兰土壤和水体样本中的微生物。他说，他每年会收到超过200次请求，询问如何使用自己发明的设备。

直接测序

尽管获得了一些成功，但微生物的培养仍然很复杂，而且还需要运气。所以很多研究人员正绕开培养过程，从微生物的DNA中获取信息。测序技术的进展让科学家可以测定单个非培养的微生物细胞的基因序列，而不是像以前那样，需要测定由多种微生物种类组成的整个群落的基因序列，再把测定出的基因片段的序列拼合在一起。

坦贾·沃伊克（Tanja Woyke）在美国能源部联合基因组研究所（Joint Genome Institute）工作，他在10年前对单细胞测序产生了兴趣。当时出现了一项重要发现：一种可感染细菌的病毒的酶，可被用来复制细菌细胞的基因组。沃伊克希望用这种工具补充生命的微生物树。

沃伊克和她的团队从9个不同的地方（包括内华达州的温泉沉积和太平洋的海底热液喷口）收集了样本。他们分离出了大约200个微生物细胞，测定每个细胞的基因组序列，然后将它们分成20个从未经过人工培养的新谱系。“从分析的序列和单细胞数量来说，他们率先把单细胞基因组学提升到了新的水平，”亨切尔说。

去年，瑞士联邦理工学院的耶恩·皮尔（Jörn Piel）和同事报告称，他们利用单细胞测序等技术，在海洋海绵中找到了未被培养过的细菌。海绵是一种滤食性生物，科学家一直对它很感兴趣，因为它能产生大量具有抗癌、抗菌和其他药学性质的化学物质。海绵还为重量达到自身40%的微生物群落提供了栖息场所。科学家猜测，这些微生物是海绵生产出的化学物质的来源。不过，这些微生物还从未被人工培养过。

皮尔和他的团队着重研究了一种石海绵（Theonella swinhoei），这种海绵内栖息着约1 000种细菌，还能产生几十种已知具有生物活性的化合物。2011年，研究人员开始测定从海绵样本中分离出的单个细菌细胞的DNA序列，并找到了两个已知的会参与生物活性分子合成的基因簇——这些基因是在名为Entotheonella的细菌中发现的。

不过，最让皮尔惊讶的是，海绵的几乎所有生物活性物质都来自上述细菌——这是因为，测序数据表明这种细菌携带了所有必需的基因。当皮尔从合作伙伴那里拿到这些关键的数据时，“我几乎从椅子上掉下来，”他说。这首次证明，没培养过的微生物在制造生物活性分子方面，可以多么有“天赋”。皮尔说：“单个菌株能生产出这么多完全不同的化学物质，这并不常见。”

皮尔的实验室现在正在把Entotheonella中的基因簇转入可以被培养的微生物（比如大肠杆菌）里，从而使宿主细胞大量合成各种化学物质。这项工作并不容易，因为参与生物合成的基因有可能会有很长的序列。皮尔还在日本、新几内亚和以色列的海绵基因组中搜索，试图找到其他“超级细菌工厂”。

搜索数据库

加利福尼亚大学旧金山分校的生化学家迈克尔·菲施巴赫（Michael Fischbach）发明了另一种分析微生物基因序列的方法：他并没有分离出单个细胞，而是筛选越来越多的细菌基因组数据。

菲施巴赫和他的团队发明了一个机器学习算法，这种算法可以被训练，从而识别出那些与合成重要分子（例如抗生素）的细菌基因相关的关键模式。随后，他们让这种算法自己在大量的微生物基因组数据中搜索带有相似特征的新基因簇。

他们的目标包括土壤和海洋中的细菌。科学家已经知道，土壤和海洋中有种类惊人的微生物。但机器算法却在人体微生物（又叫人类微生物群系，human microbiota）中找到了大量线索。菲施巴赫在获得最初结果后既兴奋又为难。兴奋是因为人体微生物产生的生物活性分子很大程度上还是一个未被研究过的领域，还可能对人类健康和疾病造成重大影响；为难是因为菲施巴赫通常只研究土壤中的微生物。

不过，菲施巴赫决定冒险一试，随后他把整个实验室的研究重点转向了人体微生物。他的团队改进了算法，用来在近2 500个人体微生物的数据中进行搜索，最终找到了超过14 000个生物合成基因簇。“在人体微生物中寻找有趣的分子非常容易，”菲施巴赫说，“因为非常容易，所以我可以这么说，发现它们并不是因为我们的搜索能力强，而是因为目标太多。”

研究团队把目标缩减至超过3 000个常见的基因簇，结果发现其中一个基因簇可以生产出抗生素lactocillin。这种抗生素通常由一种阴道微生物分泌。Lactocillin可以消灭常见的阴道致病菌（如金黄色葡萄球菌）繁殖，却不会影响正常栖息于阴道中的细菌。菲施巴赫现在正利用自己找到的基因簇，合成相应的分子，研究这些分子的结构，并与合作者一起研究它们的功能。

天然产物的研究领域更关注土壤和海洋中的微生物，而不是人体中的微生物，加拿大麦克马斯特大学（McMaster University）的化学生物学家格里·怀特（Gerry Wright）表示。“我认为研究这些基因和基因簇是个很好的主意，”他说。不过，把这些化合物转化为市场上的药物需要很多临床前工作，怀特表示。“仅仅研究分子本身，几乎不可能知道它是否适合作为药物。”而且即使某个分子看起来很有前景，把新抗生素推向市场的难度也很大。

但是，刘易斯从最近的进展中获得了希望。随着越来越多的工作聚焦于培养和分析未被培养过的微生物，他已经开始憧憬相关的研究扩大规模后会有什么发现。他希望药物发现的水平可以赶上瓦克斯曼时代——上世纪40年代到50年代，诺贝尔奖得主、微生物学家塞尔曼·瓦克斯曼（Selman Waksman）通过研究土壤微生物，系统筛查它们其他细菌生长的能力，瓦克斯曼发现了20多种抗生素。

“我们可以用这种非常有趣、以前从未用过的方法发现微生物，这才是最有意思的地方，”刘易斯说，“我们才搜索了地球母亲的一小部分。”