互动科普

面对不断涌现的各种新型化学品——如化妆品、药品，公众常常会怀疑其安全性。长期以来，研究人员使用动物来进行各项试验，以验证这些化学品是否有害于人体。然而，这些试验每年导致成千上万动物丧命，更让无数动物非伤即残，因此招来众多动物保护组织的强烈抗议。近年来，各国政府出台了一系列新的试验标准，研究机构也相继寻求其他方式来替代动物试验，以解决安全性试验与善待动物这两者之间的冲突。

在1999年，美国总统竞选中，一只毛茸茸的宠物兔子出现在公众面前：耳朵松软，一对大眼睛流露出悲哀眼神。在几个月中，这只由人扮成的兔子一直对总统候选人艾尔·戈尔（Al Gore）穷追猛打。戈尔的罪行在于，作为当时的副总统，他发起过一项化学品毒性试验计划，实施这项计划将导致近百万动物遭受痛苦或丧命。不过，对大多数观察家来说，这个计划似乎姗姗来迟。1997年，有个叫做“保卫环境”的组织就指出，在10万种常用化学品中，也许仅有1/4具有充分的安全信息。美国环境保护署（EPA）和现在有名的贸易组织——美国化学理事会都同意上述看法。戈尔将环境保护活动分子、管理者和制造商等所有相关利益团体召集在一起，对2800种化学品进行最低限度的安全性试验。在美国，这2800种化学品的年生产量或进口量都在454吨以上。通过一个公共网站，相关部门向公众昭示收集到的相关信息。

这只巨大的兔子在公众面前强调了一个根本事实：每年，成千上万的动物在常规毒性试验中死去，将来的试验计划则可能使动物死亡数量大幅度上升。美国环境保护署对约8万种化学品进行了优先性排序，还必须收集到有关它们安全性的基础信息；此外，它推出了儿童健康行动计划，打算考察胎儿接触某种化学品所受到的长期影响等复杂现象；美国环境保护署还推出了另一项计划，其重点是考察铅、汞等有毒物质对生殖和发育的神经性影响。在大西洋对岸，化学品注册、评估和认证计划（REACH）将评价欧洲年生产量或贸易量超过1吨的3万种化学品的安全性。2001年，英国医学研究理事会估计，仅仅实施这项计划就将耗费115亿美元，历时40年，动用1300多万只动物。首要问题是，现在的计划打算动用数百万只动物和数百亿美元资金，然而确定的仅仅是现有化学品的安全性；而化学工业每年都要新增成千上万种化学品。

数十年来，世界各地产业界、学术界和政府机构中少数志同道合的科学家一直在寻找途径，以解决安全性试验和善待动物这两者之间的冲突；我们两位作者也置身其中，戈尔计划为我们提供了展示才智的机会。应“保卫环境”组织的请求，本文作者之一哥尔德伯格将约翰·霍普金斯大学、卡内基-梅隆大学和匹兹堡大学的研究人员召集在一起，研究怎样使用更少的动物来实现戈尔计划的目标。

戈尔计划要收集最低限度的信息，称为筛选信息数据集，经合组织（OECD）推荐用它来评估化学品的潜在危险。通常情况下，每评价一种化学品的安全性，所进行的系列试验就需要430只实验动物。幸运的是，经合组织试图协调30个工业国家（包括美国）的科学规则及其他规则，接受了一些收集数据集系列的创新方案，根据其规定，用于实验的动物相对较少。利用经合组织的指导规则，加上重新设计了几个方案，试验人员可以从单一试验中得到多种结果，我们已经证明动物需要量可以减少80%，仅需要86只，而所需要获得的信息则有增无减。

长期以来，动物保护活动分子讥讽说，动物试验替代方法科学是为利用实验动物做安全性研究而进行的赎罪，许多科学家则嘲笑替代方法科学是多愁善感的产物，然而它却已经在兼顾动物福利与严格科学的狭窄范围内找到了立足点。替代方法科学正在改变化学品与生物品开发和安全性试验的方式。

减少、优化与替代

世界各地对安全性试验的法律要求相去甚远。例如，在欧盟，从2003年起，在存在着经过验证的替代方法的情况下，如果任何化妆品的最终产品或任何成分进行了动物试验，那么均不得上架销售；到2009年，欧盟将全面禁止利用动物来对化妆品成分进行试验。相反，美国化妆品主管机构——美国食品与药物管理局（FDA）则仅仅要求，如果销售后出现了安全性需要，相关方面提供某些安全性数据就行了。多年来，美国食品与药物管理局提出了许多指导规则，以应付有关安全性试验的抱怨，特别是对争议颇多的德雷兹眼睛刺激性测试（Draize eye test）的抱怨；在这种试验中，研究人员需要将药物滴入患白化病的兔子眼里，观察诱发性反应。

另一方面，美国食品与药物管理局及相应的欧洲机构制定了农用化学品评价方法学。一种杀虫剂的试验最少需要两年时间，动用数种动物，共1万只左右。科学家首先确定该化学品是否通过皮肤吸收和呼吸进入人体，是否残留在食用作物中，从而被人体吸收。对于每一条路径，针对各年龄段的人，包括胎儿，有各种问题需要回答，例如某人可能接触杀虫剂的时间，可能吸收的数量，以及在人体中的分布情况等等。

如果化学品不进入血流，研究人员就只关心局部滴旋（topical application）的后果。然而，如果化学品在血流中被吸收，那么就必须检验它及其所有代谢物对多种不同器官的影响。标准程序中，在大白鼠、小白鼠、狗或其他哺乳动物的整个生命期中，研究人员给这些动物饲喂这种化学品，观察各种器官的功能障碍，或者癌症和其他疾病状况。研究人员还要观察这些动物一生中的后代情况。许多目标试验可以一起进行，也可以分别进行。

实际上，9个跨国公司的代表向哥尔德伯格透露，他们的公司都利用皮氏培养皿或非哺乳动物进行试验，这些试验通常只需要鱼或蠕虫，从而确定一种化学品是否达到足以投入生产的安全程度。只有安全之后，才进行生命周期饲喂研究，以满足公司律师和管理机构的要求。本文附表列出了完整的动物试验系列，评价一种化学品或药物的安全性通常都要求进行这些试验。绝大多数政府管理部门要求进行传统的动物试验，不仅部分原因在于某些最佳替代方法属于商业秘密，而且还在于他们相信动物试验。总体而言，这些动物试验在过去毕竟保护了公众安全。

只是最近，管理当局才更公开考虑替代方法。替代方法这一概念要追溯到1959年。当时，英国大学动物福利联合会的威廉·拉塞尔（William Russell）和雷克斯·伯奇（Rex Burch）提出了“3R”原则，即减少（reduction）、优化（refinement）和替代（replacement），旨在减少动物在许多研究中注定要遭受的痛苦。替代方法再也不可能完全归属于这个R或那个R，但是“3R”原则依然具有指导意义。

减少原则意味着试验设计要用最少的动物来获得最多的信息。例如，正如为期14天的观察那样，急性系统毒性试验测定24小时内一次或多次吸收一种物质的结果。最广泛接受的急性毒性测定方法就是半数致命剂量法，或称为LD50：杀死半数实验动物所需要的剂量。为了确定致命剂量，以前试验人员把10只雄性动物和10只雌性动物编为一组，对其中的每只动物注射或饲喂一定剂量的化学品。研究人员用6~7组这样的动物进行试验，每组都接受不同的剂量，然后就得出死亡的动物数量。

试验人员渐渐认识到这种试验是过分杀戮行为，从而去寻找更合理的方法。自1989年以来，他们采用精确的统计方法，用45只动物就能得出半数致命剂量。目前，经合组织采纳了一种测定致命剂量的方法，这种方法平均只需16只动物。一项横跨大西洋两岸的研究最近完成了，它有望进一步把测定一种物质致命剂量所需的实验动物减少到6只。

另一个例子是人们熟知的临床医学非侵入性成像技术，比如X光照相、核磁共振和正电子发射断层显像等，它们能够显示大量动物器官正常状态和变异状态之间的区别。研究人员可以利用这些技术，用试验过程代替传统方法，跟踪一只动物：用一组动物开始试验，每个阶段杀一只动物，以确定动物器官的状况，比如肝脏状况。这类成像技术能够更好地控制数据，同时在这样的实验中把动物用量减少80%。

美国斯坦福大学的克里斯托弗·H·康塔格（Christopher H. Contag）和帕梅拉·R·康塔格（Pamela R. Contag）提出了更前沿的成像术：生物光子学。生物光子技术属于优化范畴，这种技术的试验设计使动物遭受更少痛苦。例如，研究人员将荧光素酶基因加入癌细胞之中，然后将这种细胞插入动物体内。这种酶具有产生“荧光”的能力，从而使癌细胞及其后代都能发光。研究人员很容易利用专门仪器对光子进行测定，从而在动物发育出可触摸肿瘤很早之前，就能监测癌细胞在各种化学品或药物影响下的增殖状况。这种方法实实在在减少了动物的痛苦，并适用于研究多种疾病的早期状况。

另一项宝贵的优化技术对于疫苗试验尤其有用，涉及确定“人道底线”，一旦收集到相关数据，就立即结束令动物痛苦的研究。举例来说，如果动物体温降到某个值以下，就再也不会恢复到正常状态；这个时候就可以终止试验，让奄奄一息的动物尽快死亡，而不损失任何数据。如果动物接种了狂犬疫苗，感染了狂犬病毒后开始打转，这就是疫苗没有效果的确切信号，即可用人道的方法让动物死去，从而使它少痛苦几小时。更理想的情形是，目前，试验许多疫苗效果的技术人员，只须在注射疫苗后检测动物的抗体水平，而不用等到动物出现明显的发病征兆才采取措施。优化还包括采用药物措施和麻醉措施，从而减轻动物的痛苦。

然而更进一步的优化措施，就是用进化阶梯中较低级的物种替代较高级的物种，因为人们认为前者遭受的痛苦更轻些。过去几年间，人们越来越普遍利用斑马鱼（zebra fish）和秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）来观察神经系统在化学品影响下的发育情况。对于这两种动物而言，科学家确定了所有重要基因的功能，如果化学品接通或断开了某种基因，研究人员就知道这种变化将如何影响蛋白质的形成和细胞代谢状况。只要洗掉基因芯片上的化学品，研究人员就能看到化学品激活了哪些基因；一个2.5厘米×5厘米的基因芯片就可以包括斑马鱼全部9000个相关基因。

最近，一些公司已经开始生产人类基因芯片，包括人们认为可以控制细胞毒性反应的芯片。今后这种技术将得到广泛应用，因为解读人类基因芯片的信息依然是巨大挑战，基因芯片技术将成为典型的替代技术。

第三个R——替代

替代意味着在试验中完全不用任何动物。大多数这类替代方法是随着社会廉价、快速和高效技术的巨大进步而出现的，并非因为追求人道本身而出现。例如，验孕等大多数激素分析，现在都用替代的（化学或免疫学）手段来完成；而以前则是需要使用活体动物的长期方法。

20世纪70年代，美国约翰·霍普金斯大学的亨利·瓦格纳（Henry Wagner）的一个偶然发现替代了热源试验，这是替代的早期例子。热源试验是将一种物质注入兔子体内，24小时后测定它的体温，从而检测出导致发热的细菌污染。瓦格纳提出了一种寿命非常短的放射性同位素来作为人类诊断成像的手段，他必须保证同位素不受细菌毒素影响，但是同位素在兔子试验结果出来的时候就没有活性了。瓦格纳知道同校的弗里德里克·邦（Frederick Bang）已经揭示了马蹄蟹的血淋巴（本质上是血）能够以可预见和可测定的方式对最重要的细菌毒素作出反应。美国食品与药物管理局很快就许可用这种内毒素检测方法（或称为LAL）来检测热源。

最近，德国康斯坦茨大学的阿尔布莱希特·温德尔（Albrecht Wendel）和本文作者之一哈通已经揭示，由于细菌毒素激活人体血液中的白细胞，从而释放被称为细胞因子的蛋白质，其中一些蛋白质指示大脑诱导发热，可以根据这种特性来检测细菌毒素，因此，简单地检测人体血液中的细胞因子，就可以揭示所有相关毒素存在的情况，从而克服内毒素检测方法的若干局限。

因为眼睛是极为敏感的器官，德雷兹眼睛刺激性测试就给兔子造成极大痛苦。为这类试验寻找替代方法，就要强调善待动物。10年前，一些研究人员开始用来自屠宰场的新鲜眼球进行试验，以取代活兔子试验，虽然几乎毫无美感可言，但是这种替代方法不仅避免了使用额外动物，而且消除了兔子的痛苦。在德国，把鸡蛋蛋黄和蛋白之间的精致的膜来作为替代试验所需角膜，已屡见不鲜。

20世纪80年代，本文作者哥尔德伯格领导的约翰·霍普金斯大学动物试验替代方法研究中心资助了一个研究项目，该项目旨在揭示各种化学品对人体角膜细胞的二维组织培养的影响情况。（在更早的时候，相关人士装扮成兔子，发起运动，反对德雷兹眼睛刺激性测试，这促使美国化妆品、盥洗用品和香料协会（CTFA）建立了这个研究中心，它隶属约翰·霍普金斯大学布隆伯格公共卫生学院）。现在几家公司以这些研究为一部分基础，已经生产出了三维组织，这些组织能够非常精确地模拟人类眼睛的外层表面，从而使试验人员不仅可以检测眼睛刺激情况，而且还可以检测微妙的结构变化。

实际上，现在研究人员可以利用皮肤、肺、眼、肌肉、黏膜和其他器官，培养出许多种人类细胞。更令人激动的是，还可以重构组织，即用在支持系统上培养的特化细胞进行三维构建。除了眼睛之外，还为皮肤、肺、胃肠道以及口腔和阴道衬里培养了人工组织。试验行业广泛应用人工组织，取代了大量的试验动物。（然而，肝脏等器官仍然需要进行实际三维培养。）

最重要的是，通过细胞培养和组织培养，研究人员能够看到一种化学品引起的生物学机理现象，而在某种程度上，从完整的动物身上是看不到这些现象的。现在，研究人员能够利用离体方法来模拟化学品引发的系列生物化学过程。将来，科学家能够通过这类研究来预测人体细胞接触化学品所发生的功能结果，比如基因变异、细胞生长变化等等。最近，美国巴尔的摩市的AP研究中心开发了一种系统，这种系统能在一个培养室中培养多种组织，这些组织能够模拟非常复杂的相互作用，比如器官代谢活动，它将一种化学物质转化成另一种化学物质，反过来又影响其他器官。虽然这些研究尚不成熟，但是有望避免使用毒效动力学研究中所需的实验动物，而毒效动力学研究涉及化学品的分布、代谢和排泄等系列现象。

就最终的替代效果而言，离体方法也许没有芯片那么彻底。制药行业开始利用相互作用的器官系统计算机模型来研究药物的效果。美国波士顿大学的查尔斯·德利西（Charles DeLisi）等人正在为虚拟人计划寻求资助，虚拟人计划是一项致力于分布式计算的未来风险事业，规模类似于人类基因组计划。虚拟人有朝一日可以模拟人体对生物学物理和化学压力的应激反应，减少对动物的需求。

说服怀疑者

然而，现在发现新替代方法的进展依然不确切。至少在美国，为替代方法研究寻找专项资金存在困难。美国国家毒理学计划与美国国家环境卫生科学研究院一起，负责协调联邦政府所有的毒理学试验项目，为替代方法研究提供大量政府资金。虽然美国政府机构对善待动物的科学有兴趣，但是过去10年间，它们为管理目的而投在替代方法研究方面的资金不足1000万美元。相反，欧盟同期投在替代方法研究和验证方面的资金则高达3亿美元，并且，在寻求替代方法方面，其成员国政府也各自投入了千百万美元的资金，仅仅德国就超过了1亿美元。（不管怎样，美国和欧盟的确投入了千百万美元的研究资金，总有一天会找到替代方法。）

在得到管理机构采纳之前，所有新替代方法都必须进行验证。在美国，替代方法确认协调委员会（ICCVAM）由15个联邦机构的代表组成，任命独立专家小组来评价可以得到的文献，包括由公司提供的方法，从而评估试验的有效性。每个管理机构依靠它的管理法令，然后自行决定是否接受试验结果。自1997年成立以来，ICCVAM已经评价了16个替代方法，其中6个获得管理当局的采纳，其余方法正在按照建议进行改进。过去，一个已经验证的试验可能要花费10年或更多时间才能得到广泛接受，但是自ICCVAM成立以来，这个过程大大缩短了。

替代方法的验证在欧洲兴起的时候，它在概念和复杂性方面与临床试验类似。就像临床试验以证据为基础，必须严格证实药物有效那样，验证试验也必须证明替代方法确实达到了设计效果。1996年，在瑞典索尔纳召开的经合组织研讨会上，科学验证概念获得了广泛的国际认同。根据所谓索尔纳原则，欧洲替代方法验证中心（ECVAM）和ICCVAM都进行了一系列“预验证”研究，以评价某种替代方法的潜力，并消除其缺点。在欧洲，如果试验过关，ECVAM通常邀请不同国家的几个实验室参加研究，针对替代试验，每个实验室都用多种指定的物质进行研究，这些实验室经常同时对一个给定的动物试验评价多种可能的替代方法。大约由35名科学家组成的委员会，代表着25个成员国、欧洲委员会、学术机构、产业界和动物福利团体，评判试验结果，而ICCVAM是以观察员身份出现。如果证明替代方法能够可靠地测定物质的有关性质，并且各个实验室得出的结果是一致的和可以再现的，那么委员会就正式宣布它有效。

例如，在最近的一项验证试验中，10个实验室用了3年时间来研究热源试验的6种替代方法，检测它们从190种未进行标记的样品中辨别出发热物质的能力，其中5项试验进行到了评价阶段。自1991年成立以来，ECVAM已经完全验证了17种替代方法，另外9种方法进入最后的同行评价阶段，还有25种方法进入最后试验或分析阶段。根据法律规定，一旦某种替代方法通过验证，就必须在欧洲应用；但屡见不鲜的是，实际上往往要延迟数年才得以应用。然而，随着欧洲管理者越来越习惯新方法，他们就将更快采纳这些新方法。

20世纪90年代初期，替代方法工作遇到了重大挫折，当时德雷兹眼睛刺激性测试替代方法的6大验证试验都失败了。这种结果令人疑惑不解，因为一些应用于化妆品行业的替代方法没有什么明显问题。通过评价其他数据，我们现在明白了这些替代方法失败的原因：将其结果与德雷兹眼睛刺激性测试本身的结果进行了比较，最后证明产生了许多错误的阳性反应。现在，ICCVAM和ECVAM正在联合评价现有的德雷兹眼睛刺激性测试及其替代方法的资料，该项研究将构成验证文件的基础，或者如有必要，将构成德雷兹眼睛刺激性测试替代方法的另一项验证试验的基础，这次我们有理由相信能够获得成功。

戈尔的兔子一度因为热量而崩溃，这位总统候选人的竞选助手不得不让它复活。这个插曲提供了一个恰当的隐喻：动物的假定敌人前来施以营救。如果科学设计的替代方法得到全面应用，那么就会大大减少实验动物的使用数量。例如，学术界和产业界一致估计，现有的替代方法可以使欧洲化学品注册、评估和认证计划所需要动物数量削减70%；一个相似的数字很可能超过美国环境保护署优先性列表中的数字。更实实在在的事情是，替代方法可能节省千百万甚至数十亿美元的资金；此外，即使不能节约数十年时间，那么也可以节约数年时间；同时还能提供更严格的相关数据。因此，新科学不仅能够更好地保护动物，而且还能更好地保护人类自己。                          

概述/新毒理学

◆传统上，家用化学品、农用化学品和其他化学品以及医疗产品的安全性试验，每年都要使用千百万只动物，这些试验常常给动物造成极大痛苦。

◆新方法涉及细胞培养、组织培养、非侵入性成像技术或简单的统计方法，可以大大减少所需要进行的动物试验，也大大减轻动物遭受的痛苦。

◆新毒理学以更严格的科学证据为基础，能节省时间和金钱。